朱娟 潘小英 吳菁 丁紅珂 何薇

(廣州醫(yī)科大學(xué)廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 510010)

X連鎖無汗性外胚層發(fā)育不良一家系的產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢

朱娟 潘小英 吳菁 丁紅珂 何薇*

(廣州醫(yī)科大學(xué)廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 510010)

目的 對一X-連鎖無汗性外胚層發(fā)育不良(XLHED)的家系進(jìn)行EDA基因診斷，探討XLHED的產(chǎn)前診斷方法及遺傳咨詢。方法 提取先證者、孕婦外周血及胎兒羊水細(xì)胞DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)結(jié)合直接測序法檢測EDA基因，并進(jìn)行針對性的遺傳咨詢及優(yōu)生指導(dǎo)。結(jié)果 孕婦為EDA基因7號外顯子c.871G>A雜合突變，先證者及胎兒均為EDA基因7號外顯子c.871G>A純合突變，孕婦經(jīng)遺傳咨詢后根據(jù)倫理原則要求終止妊娠。結(jié)論 在本家系中，EDA基因c.871G>A突變?yōu)閷?dǎo)致X-連鎖無汗性外胚層發(fā)育不良的原因，對EDA基因突變檢測可對XLHED進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

X-連鎖無汗性外胚層發(fā)育不良; 基因突變; 產(chǎn)前診斷

Objective To investigate a procedure for genetic counseling and prenatal diagnosis of X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia (XLHED) by mutation detection in a family with XLHED. Method Collected the peripheral blood and fetal amniotic fluid cells,EDAgene were amplified with polymerase chain reaction (PCR) technique and directly sequenced. Results Pregnant women appear forEDAgene 7 extra child c. 871 g>A hybrid mutation, the proband and fetus are 7 extraEDAgene show son c. 871 g>A homozygous mutations. Conclusions In this family,EDAgene 7 extra child c. 871 g>A mutations detection lead to XLHED,EDAgene mutation detection can make prenatal diagnosis for the XLHED. 【Key words】 X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia; gene mutation; prenatal diagnosis

外胚層發(fā)育不良(ectodermal dysplasia，ED) 是一種罕見的以汗腺、毛發(fā)及牙齒等外胚層組織發(fā)育不良或形態(tài)缺陷為主要特征的遺傳性疾病，出生發(fā)病率約為1∶100 000。X-連鎖無汗性外胚層發(fā)育不良(X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia，XLHED)是ED中最常見的一種類型，為X染色體連鎖隱性遺傳疾病，其臨床表現(xiàn)為毛發(fā)稀少、汗腺發(fā)育不全、前額突出、無牙或少牙畸形、皮膚及其附屬器官異常[1]。XLHED患兒由于皮膚散熱系統(tǒng)異常，早期死亡率高達(dá)30%，余者可因環(huán)境溫度、日光照射及劇烈運(yùn)動(dòng)而導(dǎo)致高熱，嚴(yán)重影響工作、生活甚至威脅生命[2]。由于無有效治療方法，產(chǎn)前診斷是預(yù)防和減少XLHED患兒出生的有效措施。本文對1例散發(fā)XLHED患兒及其母親、高危胎兒應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)結(jié)合直接測序法檢測EDA基因，并對XLHED疾病進(jìn)行遺傳咨詢和優(yōu)生指導(dǎo)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 ①先證者：男，7歲，第一胎足月順產(chǎn)，出生后發(fā)現(xiàn)全身無汗，毛發(fā)稀少，無眉，鼻梁塌陷，劇烈運(yùn)動(dòng)后煩躁，常不明原因發(fā)熱，全身皮膚干燥，粗糙，牙齒四顆，尖錐樣，上下各兩個(gè)，智力發(fā)育正常，在外院診斷為“無汗性外胚層發(fā)育不良綜合征”。②孕婦：30歲，孕2產(chǎn)1宮內(nèi)妊娠24周單活胎，為先證者母親，既往體健，全身皮膚毛發(fā)無異常，非近親婚配。孕期順利，定期產(chǎn)檢無特殊不適。③家系及其他成員：丈夫及家族中無類似病例發(fā)生。

1.2 研究方法 本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)后，遵循非指令性原則，與先證者母親及父親進(jìn)行XLHED病例的詳細(xì)咨詢，提供完備且無偏倚的信息后，先證者母親及父親均明確表示有避免再次生育XLHED患兒的愿望，遂告知其產(chǎn)前診斷的局限性及具體流程，簽署知情同意書，提取先證者、母親血樣進(jìn)行EDA基因檢測。在明確先證者EDA基因突變位點(diǎn)后，詳細(xì)告知先證者母親及父親侵入性產(chǎn)前診斷的各種并發(fā)癥及風(fēng)險(xiǎn)，簽署手術(shù)同意書后抽取羊水進(jìn)行EDA基因檢測。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室方法1.2.1.1 基因組DNA提取 抽取先證者及母親靜脈血5 ml加入EDTA抗凝管，使用廈門致善核酸自動(dòng)提取儀提取DNA。抽取胎兒羊水10 ml，使用Qiagen試劑盒進(jìn)行DNA提取，并置于-20 ℃保存。1.2.1.2 引物設(shè)計(jì)及合成EDA基因編碼區(qū)有8個(gè)外顯子，共編碼391個(gè)氨基酸。根據(jù)文獻(xiàn)[3-5]設(shè)計(jì)8對特異性引物擴(kuò)增EDA基因編碼區(qū)的8個(gè)外顯子，確認(rèn)引物核酸序列，由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成引物，見表1。

表1 EDA外顯子1-9 PCR擴(kuò)增引物序列

1.2.1.3EDA基因檢測 對樣本進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為25 μl，內(nèi)含10×反應(yīng)緩沖液，200 μmol/dNTP，上下游引物各50 ng，模板DNA100 ng，Taq 聚合酶1U。PCR反應(yīng)條件: 預(yù)變性95 ℃ 5分鐘，95 ℃變性30秒，56～60 ℃復(fù)性30秒，72 ℃ 延伸30秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測確認(rèn)后，交由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司純化后直接測序，測序結(jié)果提交PubMed-Blast與數(shù)據(jù)庫基因序列進(jìn)行比較。

1.2.2 胎兒侵入性產(chǎn)前診斷

1.2.2.1 儀器設(shè)備 ALOKA1400 超聲儀，3.5 MHz穿刺探頭，采用22G 150 mm PTC穿刺針。1.2.2.2 羊膜腔穿刺術(shù) 孕婦取仰臥位，常規(guī)消毒后，在B超介導(dǎo)下經(jīng)腹行羊膜腔穿刺提取胎兒羊水10 ml，術(shù)程順利。提取羊水DNA后，進(jìn)行EDA基因診斷。

2 結(jié) 果

檢測者DNA使用8 對引物在各自條件下分別擴(kuò)增出相應(yīng)產(chǎn)物，基因突變測序結(jié)果顯示孕婦為EDA基因7號外顯子c.871G>A雜合子突變，先證者的EDA基因7號外顯子c.871G>A純合子突變，此位點(diǎn)的鳥嘌呤(G)被腺嘌呤(A)替換，導(dǎo)致EDA基因的第291位氨基酸密碼子GGC突變成GAC,導(dǎo)致正常的甘氨酸(Gly)被精氨酸(Arg)替代。胎兒的EDA基因測序結(jié)果顯示7號外顯子c.871G>A純合子突變，與先證者一樣均為XLHED患兒。此突變位點(diǎn)與Gene 數(shù)據(jù)庫公布的人類EDA基因核苷酸序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果見圖1～3。經(jīng)過遺傳咨詢，孕婦及家屬要求根據(jù)倫理原則終止妊娠，引產(chǎn)出一男性胎兒。

圖1 先證者母親外顯子5的871位堿基突變反向測序圖

圖2 先證者外顯子5的871位堿基突變反向測序圖

圖3 胎兒外顯子5的871位堿基突變反向測序圖

3 討 論

3.1 病例分型及遺傳方式 外胚層發(fā)育不良(ED)分有汗型和無汗型兩種。有汗性外胚層發(fā)育(hidrotie ectodermal dysplasia，HED) 是一種常染色體遺傳疾病，其臨床表現(xiàn)為甲發(fā)育不良、掌跖角化過度、毛發(fā)稀疏或完全缺如等，但汗腺和皮脂腺功能正常[6]。無汗性外胚層發(fā)育不良多數(shù)為X-連鎖無汗性外胚層發(fā)育不良(XLHED)，男性發(fā)病，女性多為基因攜帶者，其臨床表現(xiàn)主要為無汗、脫發(fā)、缺牙三聯(lián)征[1，2]。本文家系的先證者具有典型臨床表現(xiàn)：全身無汗、毛發(fā)稀少、無眉、鼻梁塌陷、劇烈運(yùn)動(dòng)后煩躁、常不明原因發(fā)熱、全身皮膚干燥、粗糙、牙齒四顆，結(jié)合EDA基因結(jié)果及家系分析可臨床診斷為XLHED。XLHED為X染色體連鎖隱性遺傳疾病,傳遞給男性后代致病,傳遞給女性后代為雜合攜帶者,其遺傳規(guī)律如下：①XLHED男性患者與正常女性結(jié)婚，其兒子100%正常，其女兒100%為攜帶者。②正常男性與XLHED女性攜帶者結(jié)婚，其兒子50%正常，50%為患者；其女兒50%正常，50%為攜帶者。③XLHED男性患者與XLHED女性攜帶者結(jié)婚，其兒子50%正常，50%發(fā)??；其女兒50%為攜帶者，50%發(fā)病。④正常男性與XLHED女性患者結(jié)婚，其兒子100%為患者，女兒100%為攜帶者。本例家系中先證者母親為EDA基因攜帶者，先證者父親無異常，若其夫妻要求繼續(xù)生育，均需進(jìn)行遺傳方式的咨詢及胎兒EDA基因產(chǎn)前診斷。

3.2 病因 XLHED的致病基因EDA定位于Xq12～13.1，其基因主要在外胚層中與角質(zhì)、毛囊、汗腺等起源相關(guān)的細(xì)胞中表達(dá)，其編碼區(qū)共有8個(gè)外顯子，編碼的ectodysplasin-A蛋白含有391個(gè)氨基酸，為Ⅱ型三聚體單次跨膜蛋白，具有細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、酶裂解結(jié)構(gòu)域、膠原樣結(jié)構(gòu)域及腫瘤壞死因子(TNF)同源結(jié)構(gòu)域，在各個(gè)結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)均可發(fā)現(xiàn)EDA突變，至今報(bào)道各類突變已達(dá)200多種[7]。本研究中先證者與胎兒的EDA基因7號外顯子第871位點(diǎn)的鳥嘌呤(G)被腺嘌呤(A)轉(zhuǎn)換，使EDA基因的第291位氨基酸密碼子GGC突變成GAC，使正常的甘氨酸(Gly)被精氨酸(Arg)替代，此突變位于TNF同源結(jié)構(gòu)域，會導(dǎo)致蛋白合成提前終止，從而影響了EDA基因編碼的ectodysplasin-A蛋白與相應(yīng)受體的結(jié)合，中斷或消弱了正常外胚層上皮細(xì)胞信號通路，影響皮膚及其附屬物的正常發(fā)育[8]。

3.3 產(chǎn)前診斷 XLHED的患者由于汗腺發(fā)育不全，散熱困難，臨床上僅能通過物理方法對癥治療，病死率高，存活至成年者較少[2]，因此該病的產(chǎn)前診斷有重要意義。對有或疑有XLHED家族史的孕婦應(yīng)進(jìn)行遺傳咨詢，需對家族中的先證者、可能的攜帶者及孕婦進(jìn)行家系分析及EDA基因診斷，明確家系中EDA突變位點(diǎn)后，方可對其胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷。同時(shí)需告知遺傳異質(zhì)性，不排除臨床表現(xiàn)典型卻無法找出相關(guān)基因突變位點(diǎn)。除了通過侵入性產(chǎn)前診斷方法獲取臍血、羊水、絨毛進(jìn)行EDA基因產(chǎn)前診斷外，有文獻(xiàn)報(bào)道可通過提取母親外周血中游離胎兒細(xì)胞進(jìn)行EDA基因診斷[9]，也有報(bào)道在中孕晚期利用胎兒鏡行宮內(nèi)胎兒皮膚活檢，取胎兒皮膚進(jìn)行組織病理學(xué)分析[10]。當(dāng)胎兒經(jīng)過產(chǎn)前診斷確診為XLHED患兒時(shí)，需遵循知情同意及知情選擇原則，向孕婦及家屬提供真實(shí)、充分的信息，并進(jìn)行有效的遺傳咨詢，同時(shí)需尊重孕婦及家屬的選擇。若其要求保留胎兒，應(yīng)告知其在胎兒出生后需及早采取措施避免或減少高熱帶來的嚴(yán)重后遺癥的危害，并盡早治療。

本文對1例散發(fā)XLHED家系找出EDA基因突變位點(diǎn)并進(jìn)行產(chǎn)前診斷，通過有效的遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷是預(yù)防和減少XLHED患兒出生的有效措施。

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編輯：宋文穎

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中國產(chǎn)前診斷雜志(電子版)編輯部

10.13470/j.cnki.cjpd.2015.04.010

*通訊作者：何薇，E-mail：12364780@qq.com

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2015-09-09)