郭月英,程海星,王 樂,劉樹軍,張 靜,任 霆,靳 燁,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2.烏拉特中旗農(nóng)區(qū)畜牧業(yè)專項推進(jìn)辦公室,內(nèi)蒙古巴彥淖爾市 015300)

蘇尼特羊鈣蛋白酶抑制蛋白基因表達(dá)規(guī)律及其與肉質(zhì)的相關(guān)性研究

郭月英1,程海星1,王 樂1,劉樹軍2,張 靜1,任 霆1,靳 燁1,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2.烏拉特中旗農(nóng)區(qū)畜牧業(yè)專項推進(jìn)辦公室,內(nèi)蒙古巴彥淖爾市 015300)

選取40只蘇尼特羊為研究對象,采用相對定量PCR技術(shù)對不同月齡蘇尼特羊背最長肌、臂三頭肌、股二頭肌中CAST基因的表達(dá)規(guī)律與肉質(zhì)相關(guān)性進(jìn)行研究,分析基因表達(dá)量與肉質(zhì)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明:CAST在三個實驗部位中的表達(dá)規(guī)律相同,5、6、8月齡有不同程度的增高,12月齡降到最低。4個月齡中,CAST基因的表達(dá)量為臂三頭肌(Q)>股二頭肌(H)>背最長肌(B)。5月齡時股二頭肌(H)和背最長肌(B)表達(dá)量基本相同,8月齡時,臂三頭肌(Q)和股二頭肌(H)表達(dá)量基本相同。在8、12月齡時,臂三頭肌(Q)中CAST基因的表達(dá)量顯著高于背最長肌(B)。在背最長肌中,CAST基因表達(dá)量與剪切力(r=-0.449)、黃度值(r=-0.753)、pH2(r=-0.245)呈負(fù)相關(guān);與紅度值呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.950,p=0.050);與亮度值(r=0.171)、pH1(r=0.387)呈正相關(guān);在股二頭肌中,CAST基因表達(dá)量與剪切力(r=0.520)、黃度值(r=0.846)呈正相關(guān);與紅度值(r=-0.091)、亮度值(r=-0.193)、pH1(r=-0.446)、pH2(r=-0.446)呈負(fù)相關(guān)。在臂三頭肌中,CAST基因表達(dá)量與剪切力(r=0.333)呈正相關(guān);與紅度值(r=-0.494)、黃度值(r=-0.465)、亮度值(r=-0.317)、pH1(r=-0.814)、pH2(r=-0.629)呈負(fù)相關(guān)。

蘇尼特羊,鈣蛋白酶抑制蛋白基因,相對定量PCR,表達(dá)規(guī)律,肉質(zhì)

蘇尼特羊因其具有耐粗飼、耐寒、體格健壯,骨骼結(jié)實、采食能力強、生長發(fā)育快、宜于牧養(yǎng)、成活率高,生命力強、瘦肉率高、肉質(zhì)鮮嫩等優(yōu)點,而成為適應(yīng)荒漠半荒漠草原環(huán)境的地方良種之一[1-2]。肉質(zhì)是一個綜合性狀,受到多種因素的影響,從本質(zhì)上講,對肉質(zhì)起決定作用的主要是肌肉本身的組織結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成。肉質(zhì)性狀的形成是基因和環(huán)境相互作用的產(chǎn)物。研究表明,遺傳因素即基因?qū)θ赓|(zhì)起著關(guān)鍵作用[3-4]。目前,評定肉質(zhì)的主要指標(biāo)一般包括嫩度、肉色、風(fēng)味、保水性、肌內(nèi)脂肪含量、pH等。

鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin,CAST)普遍存在于哺乳動物的組織中,是鈣蛋白酶的內(nèi)源性抑制蛋白,由CAST基因編碼。CAST基因在肌肉的形成、降解及宰后的嫩化過程中起關(guān)鍵作用[5],是家畜胴體瘦肉率和嫩度的候選基因。國內(nèi)外已經(jīng)有一些CAST基因多態(tài)與肉質(zhì)相關(guān)性研究的報道,Ciobanu等[6]在豬的CAST基因研究中發(fā)現(xiàn)了一個新的等位基因的單倍型,該單倍型具有更好的嫩度和多汁性。楊又兵[7]發(fā)現(xiàn)豬的CAST基因的不同酶切多態(tài)位點對眼肌面積、個體高度、肌內(nèi)脂肪、肌內(nèi)水分等性狀有顯著影響。張璐等[8]研究得出豬CAST基因的不同基因型的背膘厚存在差異。吳舊生[9]發(fā)現(xiàn)金皮豬CAST基因的HinfⅠ多態(tài)性對肌纖維的軸比、結(jié)締組織含量有著影響。在牛的研究中也有類似報道,Allais等[10]對法國三個品種牛的研究中發(fā)現(xiàn),CAST基因的不同基因型與牛肉的風(fēng)味和剪切力存在相關(guān)性。王建華[11]對牦牛CAST基因多態(tài)性與肉質(zhì)進(jìn)行了研究,得出CAST基因的不同基因型分別與牦牛肌肉的剪切力、脂肪含量、失水率、含水量密切相關(guān)。金鑫[12]對延邊黃牛的肉質(zhì)性狀相關(guān)基因的研究中發(fā)現(xiàn),CAST基因的突變位點E1-1、E1-2、C3-1與嫩度和多種脂肪酸含量顯著相關(guān),E4-2與蒸煮損失和肉色顯著相關(guān)。同時,部分學(xué)者還對CAST基因表達(dá)量與肉質(zhì)的相關(guān)性進(jìn)行了研究,趙伯陽[13]發(fā)現(xiàn)山羊CASTⅡ基因的表達(dá)量隨著年齡的增長而增加,3歲時的表達(dá)量最高;在雞的研究中發(fā)現(xiàn)CAST基因在胸肌中表達(dá)量總體呈下降趨勢[14]。

蘇尼特羊是我國優(yōu)良的地方品種,經(jīng)過長期自然和人工選擇,其體內(nèi)蘊藏著豐富的基因資源,而目前對蘇尼特羊生長期CAST基因的表達(dá)量與肉質(zhì)的相關(guān)性研究尚屬空白,因此,本文對蘇尼特羊背最長肌、臂三頭肌、股二頭肌中CAST基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究,分析了表達(dá)量與肉質(zhì)指標(biāo)剪切力、色差、pH的相關(guān)性,以期為CAST基因?qū)μK尼特羊肉質(zhì)的影響提供相關(guān)理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗原料 選取內(nèi)蒙古巴彥淖爾市五原縣巴美肉羊養(yǎng)殖示范基地蘇尼特羊40只,實驗個體在相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng),5、6、8、12月齡時分別屠宰10只。

1.1.2 實驗藥品 RNAiso Plus、Premix Taq? Version2.0(Loading dye mix)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMII、pMD19-T Vector Kit 大連寶生物工程有限公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 中科瑞泰北京生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 CFX96TMReal-Time PCR Detection System 美國Bio-rad公司；TC-P2A 全自動測色色差計 上海生物生化實驗儀器公司；CL-M嫩度儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；PCR儀 Biometra；低溫臺式高速冷凍離心機 Eppendorf5417R德國；BG-power 3500穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-rad公司；核酸蛋白分析儀 美國Bio-rad公司；-80℃超低溫冰箱 Forma Scientific。

1.2 實驗方法

1.2.1 肉樣采集 對40只蘇尼特羊在屠宰后45min內(nèi)各取肌肉約100mg,裝入標(biāo)記好的無酶凍存管,投入液氮中,帶回后-80℃保存,用于RNA提取。

1.2.2 指標(biāo)測定 實驗用羊在內(nèi)蒙古漁蒙家食品有限公司進(jìn)行肉質(zhì)性狀指標(biāo)測定。肉質(zhì)指標(biāo)測定包括嫩度(剪切力)、色差(含紅、黃與亮度值)、pH。羊胴體沿脊柱左右劈半,左半胴體宰后45min測其pH,記pH1,4℃冷庫中懸掛排酸,24h再次測pH,記pH2。取右半胴體的背最長肌、臂三頭肌、股二頭肌,按參考文獻(xiàn)方法[15-16],測定剪切力與色差。

1.2.3 引物設(shè)計 相對定量引物根據(jù)NCBI公布的基因序列,用軟件Primer premier 5.0和在線軟件Primer premier 3.0設(shè)計,管家基因(磷酸甘油醛脫氫酶)引物參考文獻(xiàn)[17]所列,引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物信息如表1所示。

表1 實時定量引物

1.2.4 RNA提取 采用TaKaRa RNAiso Plus按試劑盒使用說明進(jìn)行總RNA提取。取4μL總RNA,加入236μL無酶水,用微量核酸蛋白分析儀測定其濃度,-70℃保存。RNA濃度=60×讀取濃度[18]

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄制備cDNA第一鏈 稀釋RNA樣品濃度為500μg/mL。使用寶生物(大連)工程有限公司TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.5.1 去除基因組DNA 按表2在冰上配制反應(yīng)混合液,將體系混合物在PCR儀中42℃、2min,去除基因組DNA,4℃保存。

表2 去除基因組DNA反應(yīng)體系

1.2.5.2 反轉(zhuǎn)錄制備cDNA第一鏈 采用SYBR? Green qPCR法反轉(zhuǎn)錄,發(fā)轉(zhuǎn)錄體系如表3所示,反轉(zhuǎn)錄條件:37℃、15min;85℃、5s;4℃、24h。得到的cDNA濃度為50ng/μL,4℃保存。

表3 反轉(zhuǎn)錄體系

1.2.6 相對定量PCR擴增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件及產(chǎn)物檢測 按照CFX96TMReal-Time PCR Detection System操作方法進(jìn)行程序設(shè)置。使用TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMII(TLi RNaseH Plus)進(jìn)行相對定量PCR擴增。以上一步反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板,按表4配制PCR反應(yīng)液。以GAPDH管家基因,對CAST基因進(jìn)行相對定量分析。目的基因與管家基因分別做4個平行樣與2個陰性對照。PCR反應(yīng)體系如表4。

表4 實時定量PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s;退火30s(各基因?qū)?yīng)的退火溫度,如表1所示);,72℃延伸30s;35個循環(huán);72℃延伸10min;4℃保存。

Real-time PCR產(chǎn)物檢測:吸取5μL上述PCR產(chǎn)物,加入3μL 6×Loading Buffer,混勻,1.0%瓊脂糖凝膠、120V電泳15min,凝膠成像系統(tǒng)檢測、拍照。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理方法 實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,用One-Way ANOVA方差分析進(jìn)行顯著性分析,采用最小顯著極差法(LSD)檢驗。

相對定量數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法,計算公式:①相對表達(dá)量(fold change)=2-ΔΔCt;②ΔΔCt=(Ct目的基因-CT內(nèi)參基因)處理組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)未處理組[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取

由圖1可見,28S、18S處條帶清晰明亮,總RNA完整無降解。經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測OD值均在1.7～1.9之間,總RNA純度較高,濃度均符合實驗要求,可用于反轉(zhuǎn)錄實驗。

圖1 總RNA電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the total RNA注:泳道1、2、3是隨機選取的RNA。

2.2 PCR反應(yīng)產(chǎn)物

PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后,用凝膠成像系統(tǒng)檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量。從圖2可以看出:GAPDH、CAST基因的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后條帶單一,無引物二聚體和非特異性擴增,大小與預(yù)期片段相符。切膠回收目的片段,測序分析,與GenBank數(shù)據(jù)庫中的GAPDH、綿羊的CAST基因序列比對,同源性100%,確定產(chǎn)物為目的片段,引物符合實驗要求。

圖2 目的基因PCR電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of target gene

2.3 蘇尼特羊CAST基因表達(dá)發(fā)育規(guī)律

蘇尼特羊CAST基因5、6、8、12月齡的表達(dá)量規(guī)律,如表5所示。

表5 蘇尼特羊CAST基因表達(dá)發(fā)育規(guī)律

注:同行小寫字母肩注相同,表示差異不顯著,肩注不同表示差異顯著(p<0.05),縱行大寫字母肩注相同,表示差異不顯著,肩注不同表示差異顯著(p<0.05)。

表6 蘇尼特羊5、6、8、12月齡肉質(zhì)測定結(jié)果

注:同行小寫字母肩注相同,表示差異不顯著,肩注不同表示差異顯著(p<0.05),縱行大寫字母肩注相同,表示差異不顯著,肩注不同表示差異顯著(p<0.05)。pH1表示屠宰后45min的pH,pH2表示屠宰后24h的pH。

由表5可以看出,CAST在三個實驗部位中的表達(dá)規(guī)律相同,5、6、8月齡有不同程度的增高,12月齡降到最低。燕鳳[20]研究結(jié)果顯示,80～200日齡的灘羊、蒙古羊、小尾寒羊中CAST基因的表達(dá)量隨著日齡的增加不斷提高,與本研究5～8月齡的實驗結(jié)果類似。4個月齡不同部位比較,CAST基因的表達(dá)量為臂三頭肌(Q)>股二頭肌(H)>背最長肌(B)。5月齡時股二頭肌(H)和背最長肌(B)表達(dá)量基本相同,8月齡時,臂三頭肌(Q)和股二頭肌(H)表達(dá)量基本相同。在8、12月齡時,臂三頭肌(Q)中CAST基因的表達(dá)量顯著高于背最長肌(B)。

2.4 蘇尼特羊肉質(zhì)測定結(jié)果

由表6可看出,在測定的三個部位中,剪切力值在6月齡時均高于5、8和12月齡,由于剪切力越大,嫩度越低,因此由表可知,5、8和12月齡時蘇尼特羊的嫩度較好。經(jīng)顯著性分析可以看出,在背最長肌中,6、8月齡的嫩度存在顯著差異;在股二頭肌中,6月齡的剪切力顯著高于5、8月齡,在臂三頭肌中,6月齡與5、8、12月齡的剪切力存在顯著差異。同一月齡不同部位間的剪切力經(jīng)顯著性分析可以看出,8月齡時,股二頭肌和臂三頭肌的嫩度存在顯著差異。

在測定三個部位的肌肉中,背最長肌中的紅度值,12月齡與5、6、8月齡的紅度值存在顯著性差異;5月齡與8月齡的紅度值存在顯著差異;12月齡的紅度值最高。在股二頭肌中,4個測定月齡間紅度值不存在顯著性差異。在臂三頭肌中,12月齡的紅度值顯著高于5、6、8月齡。在8月齡時,背最長肌的紅度值顯著低于股二頭肌和臂三頭肌。

黃度值在背最長肌和股二頭肌中,各個月齡間均無顯著性差異。在臂三頭肌中,5月齡和6月齡存在顯著差異,4個測定月齡中,6月齡時的黃度值最低。同一月齡不同部位間,黃度值無顯著差異。

在背最長肌中,8月齡亮度值與5、6月齡存在顯著差異;12月齡與5、6月齡存在顯著差異,8月齡與12月齡間的差異不顯著。在股二頭肌中,5月齡的黃度值與6、8、12月齡間存在顯著差異,5月齡時的黃度值最高,12月齡最低。在臂三頭肌中,5月齡的黃度值與6、8、12月齡間存在顯著性差異。5月齡時,背最長肌與臂三頭肌的亮度值存在顯著性差異。6月齡時,臂三頭肌的亮度值分別于背最長肌和股二頭肌的亮度值存在顯著性差異。8月齡時,背最長肌和臂三頭肌中的亮度值存在顯著性差異。12月齡時,三個部位間的亮度值差異不顯著。

在背最長肌中,5月齡的pH1顯著高于6月齡和12月齡。在股二頭肌中,5月齡時的pH1顯著高于6、8、12月齡的pH1;6月齡pH1值顯著高于12月齡。在臂三頭肌中,5月齡的pH1顯著高于8月齡。6月齡和12月齡時,背最長肌中的pH1顯著低于臂三頭肌的pH1。

在臂三頭肌中,5月齡時的pH2分別與6、8、12月齡間的pH2存在顯著性差異。其它兩個部位中,各個月齡間的pH2無顯著差異。5月齡時,臂三頭肌中的pH2顯著高于背最長肌和股二頭肌。8月齡時,背最長肌的pH2顯著低于股二頭肌和臂三頭肌。

2.5 蘇尼特羊CAST基因表達(dá)量與肉質(zhì)的相關(guān)性

由表7可以看出,在背最長肌中,CAST基因表達(dá)量與剪切力呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)-0.449;與紅度值呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)-0.950(p=0.050);與黃度值呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)-0.753;與亮度值呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)0.171;與pH1呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)0.387;與pH2呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)-0.245。

表7 蘇尼特羊臂三頭肌中CAST基因表達(dá)量與肉質(zhì)的相關(guān)性

注:肩注*表示相關(guān)性顯著(p<0.05),**表示相關(guān)性極顯著(p<0.01)。

在臂三頭肌中,CAST基因表達(dá)量與剪切力呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)0.333;與紅度值呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)-0.494;與黃度值呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=-0.465;與亮度值呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=-0.317;與pH1呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)-0.814;與pH2呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)-0.629。

在股二頭肌中,CAST基因表達(dá)量與剪切力呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)0.520;與紅度值呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)-0.091;與黃度值呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)0.846;與亮度值呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)-0.193;與pH1呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)-0.446;與pH2呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)-0.446。

實驗結(jié)果顯示,在蘇尼特羊的3個測試部位中,CAST基因的表達(dá)量與剪切力呈現(xiàn)不同的相關(guān)關(guān)系。Ilian等[21]研究了宰后72h肉嫩度的變化與鈣蛋白酶系統(tǒng)的關(guān)系,得出calpastatin mRNA的表達(dá)與肉嫩度沒有相關(guān)性,與本實驗結(jié)果有所差異,這種差異可能是物種不同引起的。唐仁勇[22]對μ-Calpain,Calpastatin與豬肉嫩度的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn),μ-Calpain基因表達(dá)量增加時,豬肉嫩度較好,而Calpastatin基因表達(dá)量增加則會使豬肉嫩度降低,與本實驗臂三頭肌和股二頭肌中的實驗結(jié)果類似。

3 結(jié)論與討論

CAST基因是影響家畜肉質(zhì)的重要候選基因,近年來受到了廣泛的關(guān)注。姚慧等[23]的研究顯示,CAST基因在牦牛心、肝、脾、肺、腎、胃、眼肌、腹肌等不同組織中均有表達(dá),在不同組織的表達(dá)量存在差異。陳春華等[24]在甘肅肉牛CAST基因的研究中發(fā)現(xiàn)3個多態(tài)位點。管凇等[25]對海南黑山羊CAST基因表達(dá)差異和發(fā)育規(guī)律進(jìn)行研究,結(jié)果表明,骨骼肌中mRNA表達(dá)量極顯著高于其他組織,2月齡時達(dá)到最高水平。本實驗結(jié)果顯示5、6、8月齡時,CAST基因的表達(dá)量隨月齡增大而升高,12月齡時降到最低。在3個測試部位中,CAST基因的表達(dá)量發(fā)育規(guī)律為臂三頭肌(Q)>股二頭肌(H)>背最長肌(B),且CAST基因的表達(dá)量與剪切力呈現(xiàn)不同的相關(guān)關(guān)系。CAST基因在不同品種和物種間表達(dá)既有一定的相似性也存在差異,因此,本研究結(jié)果對蘇尼特羊肉質(zhì)及蘇尼特羊品種選育均具有重要意義。

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Analysis of expression of calpastatin gene and its correlation with meat traits in Sunit Sheep

GUO Yue-ying1,CHENG Hai-xing1,WANG Le1,LIU Shu-jun2,ZHANG Jing1,REN Ting1,JIN Ye1,*

(1. College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China;2. Special Advancing Office of Graziery,Urat Middle County,Bayannur 015300,China)

Correlation of the expression with meat quality had been investigated. Relative quantization PCR was used to evaluate the expression of CAST in 40 Sunit sheep of different month ages. The shear force,pH,color were measured after being slaughtered. The correlation between the expression and the quality of meat were analyzed. The results showed that the expression pattern of CAST gene were same in three muscles in Sunit sheep,the expression of 5,6,8 mouth ages were rising and it was lowest in 12 month age. The expression in 4 month age was:triceps>biceps femoris>longissimus dorsi. The expression was nearly same in biceps femoris and longissimus dorsi in 5 month age. The expression was nearly same in triceps and biceps femoris in 8 month age. The expression in triceps was higher than longissimus dorsi significantly in 8 and 12 month age. The expression of CAST gene in longissimus dorsi had negative correlation with shear force(r=-0.449),yellowness(r=-0.753),pH2(r=-0.245), had significant negative correlation with redness-0.950(p=0.050),had positive correlation with lightness(r=0.171),pH1(r=0.387).The expression of CAST gene in biceps femoris had positive correlation with shear force(r=0.520),yellowness(r=0.846),had negative correlation with redness(r=-0.091),lightness(r=-0.193),pH1(r=-0.446),pH2(r=-0.446). The expression of CAST gene in triceps had positive correlation with shear force(r=0.333)and negative correlation with redness,yellowness,lightness,pH1and pH2,the correlation coefficients were-0.494,-0.465,-0.317,-0.814,-0.629 respectively.

Sunit sheep;calpastatin gene;relative quantization PCR;expression;meat quality

2014-05-07

郭月英(1977-),女，博士研究生，講師，研究方向：畜產(chǎn)品加工與貯藏。

*通訊作者:靳燁(1964-)，男，博士，教授，研究方向：畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)。

國家自然基金項目(31160330，31360393)。

TS251.1

A

1002-0306(2015)07-0122-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.017