膽汁螺桿菌實時熒光定量PCR檢測方法的建立

伍妙梨,袁 文,饒 丹,王 靜,朱余軍,尹雪琴,黃 韌,郭鵬舉
（廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663）

目的 建立快速、敏感、特異的膽汁螺桿菌（Helicobacter bilis，H.bilis）TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法，對膽汁螺桿菌進行定量檢測。方法 PCR擴增H.bilis保守基因P17序列全長ORF435 bp，進行TA克隆，構(gòu)建質(zhì)粒標準品pMD-HBP17。通過對pMD-HBP17標準品的定量分析，優(yōu)化反應體系，檢測TaqMan探針實時熒光定量PCR方法的靈敏度、特異性及重復性；用所建立的qPCR方法檢測77份臨床樣品，并與普通PCR的檢測結(jié)果作比對。結(jié)果 所建立的qPCR檢測方法，質(zhì)粒DNA濃度在108～101拷貝之間表現(xiàn)出較好的線性和相關(guān)性，所得標準曲線的斜率為-3.46，相關(guān)系數(shù)為0.999，檢測靈敏度達到20個拷貝，對77份臨床樣品的檢出率為14.3％，較普通PCR（7.8％）的檢出率高。結(jié)論 建立的H.bilis qPCR檢測方法特異性好、敏感性高、穩(wěn)定性強，可用于膽汁螺桿菌的定量及定性檢測。

膽汁螺桿菌（H.bilis）；熒光定量PCR（qPCR）；TaqMan探針

嚙齒動物螺桿菌（rodent helicobacter）是指寄居于嚙齒動物消化道的一群螺桿菌屬細菌的總稱，目前從大鼠、小鼠、沙鼠等嚙齒動物中已陸續(xù)分離到三十多種嚙齒動物螺桿菌，其中重要的有膽汁螺桿菌 （Helicobacter bilis）、肝 螺 桿 菌 （Helicobacter hepatitis）、嚙齒類螺桿菌（Helicobacter rodentium）等［1]。膽汁螺桿菌是嚙齒類實驗動物的重要致病菌之一，常呈隱性感染，其感染會嚴重影響實驗動物的品質(zhì)，而被國際實驗動物理事會列為嚙齒類實驗動物必須排除的病原微生物［2]。傳統(tǒng)的膽汁螺桿菌的檢測方法主要包括分離培養(yǎng)法、PCR等。鑒于膽汁螺桿菌的生長條件苛刻，分離培養(yǎng)的成功率較低而不適用于臨床鑒定；普通PCR技術(shù)通過對擴增后的產(chǎn)物進行電泳檢測分析，雖然敏感性較高，但存在假陽性問題。實時熒光定量PCR（qPCR）通過實時檢測熒光量的變化，獲得不同樣品達到一定熒光信號時所需的循環(huán)次數(shù)進而通過計算對模板進行準確定量，具有操作簡單、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強、重復性好等優(yōu)點［3]。本研究旨在建立一種靈敏度高、特異性強、快速準確檢測膽汁螺桿菌的TaqMan探針熒光定量PCR方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及臨床樣本

膽汁螺桿菌ATCC51630購自美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC），大腸桿菌DH-5α菌株均由本實驗室保存。臨床樣本為SD大鼠和野鼠的盲腸內(nèi)容物，SD大鼠來源于2014年本實驗室收到廣東省送檢的SD大鼠，背景調(diào)查表明該SD大鼠曾飼養(yǎng)于普通環(huán)境，共52只。野鼠為褐家鼠，捕獲于廣州市某實驗動物養(yǎng)殖場附近，共25只。無菌采集活體大鼠和野鼠的盲腸內(nèi)容物，樣本采集在本實驗室的屏障環(huán)境實驗間【SYXK（粵）2012-0122】進行，-20℃保存。

1.1.2 試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒均購自天根生化科技有限公司；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）、Premix Ex TaqTMVersion2.0、pMDTM19-T Vector等均購自TAKARA公司。

1.1.3 儀器

ABI7500熒光定量PCR儀，檢測軟件為SDS1.4版本。

1.1.4 引物及探針的設(shè)計合成

根據(jù)NCBI中膽汁螺桿菌P17基因序列的保守區(qū)域設(shè)計一對特異性qPCR引物（P17-F1、P17-R1）及探針（P17-probe），同時設(shè)計一對普通引物（P17-F2、P17-R2）擴增P17全長基因片段（表1）。引物及探針均由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌基因組DNA的提取

按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作步驟提取膽汁螺桿菌的基因組DNA，并用紫外分光光度計檢測所獲得的DNA的純度及濃度。

1.2.2 H.bilis P17基因全長ORF的PCR擴增

以抽提的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，取2μL基因組DNA加入2μL引物（10μmol/L），25μL Premix Ex Taq，加滅菌蒸餾水到反應總體系為50μL。95℃預變性5 min后，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)擴增30次，72℃終延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后用DNA純化回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物-20℃保存。

1.2.3 H.bilis P17質(zhì)粒標準品的制備

將擴增的H.bilis P17基因片段PCR產(chǎn)物純化后進行TA克隆插入pMD-19T載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，經(jīng) PCR鑒定后送invitrogen公司測序。將測序正確的陽性克隆增殖培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。通過紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度，并根據(jù)公式：C=（N×6.02×1023）/（MW× 109）計算質(zhì)粒拷貝數(shù)。C為每μL質(zhì)粒中所含目的基因拷貝數(shù)；N為質(zhì)粒濃度，單位為ng/μL；MW為重組質(zhì)粒分子量。

表1 所用引物及探針Tab.1 Primer and probe

1.2.4 qPCR反應體系的建立和優(yōu)化

根據(jù)TAKARA Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）的操作說明書配制qPCR反應體系，分別對引物濃度（0.1μmol～1μmol），探針濃度（0.1μmol～1 μmol）、循環(huán)數(shù)（36～45個循環(huán)）等條件進行優(yōu)化，通過比較Ct值、熒光強度來判定優(yōu)化結(jié)果。

1.2.5 敏感性試驗及線性標準曲線的繪制

將H.bilis P17質(zhì)粒標準品母液進行10倍梯度稀釋，取108～100copies/μL這8個梯度稀釋度的質(zhì)粒作為qPCR反應模板，每個稀釋度做3個重復，同時以pMD-19T空質(zhì)粒為陰性對照，ddH2O為空白對照。通過實時熒光定量PCR儀自動繪制線性標準曲線。

1.2.6 qPCR檢測方法特異性分析

同時使用小家鼠螺桿菌（H.muridarum）、嚙齒類螺桿菌（H.rodentium）、肝螺桿菌（H.hepatitis）、盲腸螺桿菌（H.typhlonius）、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌等細菌DNA作為模板進行H.bilis qPCR特異性檢測，同時以pMD-19T空質(zhì)粒為陰性對照，水作為空白對照，每個樣品做2個重復。

1.2.7 qPCR檢測方法重復性分析

測定5個濃度梯度模板的Ct值，重復5次，通過計算Ct值的變異系數(shù)CV來評價檢測方法的重復性。

1.2.8 H.bilis qPCR檢測方法的臨床應用

用本研究建立的 qPCR方法和普通 PCR方法［4]檢測普通級別大鼠及野鼠的盲腸樣品，并對比兩種方法的檢出率。

2 結(jié)果

2.1 pMD-HBP17質(zhì)粒的構(gòu)建

以膽汁螺桿菌的基因組DNA為模板，通過PCR擴增H.bilis P17基因全長ORF435 bp，通過TA克隆制備重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)過PCR鑒定陽性（圖1）。陽性菌株經(jīng)測序鑒定與NCBI中H.bilis P17基因片段序列一致。

2.2 qPCR反應體系的建立

通過 ABI7500系統(tǒng)隨機軟件 SDS1.4分析qPCR結(jié)果。得出最佳反應條件是每20μL反應體系中加入 10μL Premix Ex Taq，0.2 μLROX Reference DyeII，上下游引物各0.2μmol，探針0.1 μmol，模板2μL。ABI7500反應程序為：95℃預變性30 s后進入PCR擴增階段，95℃ 5 s，60℃ 34 s，同40個循環(huán)。其中60℃ 34 s為熒光收集階段。

2.3 定量線性分析及敏感度檢測

將pMD-HBP17質(zhì)粒標準品進行10倍梯度稀釋后，以2×108～2×100copies/μL稀釋度作為模板進行qPCR反應，結(jié)果顯示：2×108～2×101copies/μL濃度之間，標準曲線線性較好，擴增曲線呈典型的S型（圖2），每組復孔間曲線擬合情況較好，相鄰兩組間起峰的循環(huán)數(shù)基本維持在3個循環(huán)左右，Ct值落在9～35之間。標準曲線定量線性方程所得斜率為-3.46，截距為37.51，線性相關(guān)系數(shù)為0.999。而2 ×100copies/μL組因模板濃度較低，接近TaqMan探針的臨界檢測濃度，復孔重復性不如前面8組，誤差偏大，線性相關(guān)性不好，故排除。因此，本研究中標準品定量20拷貝以上能表現(xiàn)較好線性和相關(guān)性，故本方法檢測的靈敏度為20個拷貝。定性判定可認為Ct值大于35為陰性，Ct值小于35為陽性。

圖1 重組質(zhì)粒pMD-HBP17的PCR鑒定Note.DL2000 DNA Marker（M）and positive plasmid colony of pMD-HBP17（1～5）.Fig.1 Result of PCR identification of the recombinant plasmid pMD-HBP17

2.4 qPCR檢測方法特異性分析

對小家鼠螺桿菌（H.muridarum）、嚙齒類螺桿菌（H.rodentium）、肝螺桿菌（H.hepatitis）、盲腸螺桿菌（H.typhlonius）、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌等進行檢測，結(jié)果顯示其他幾種螺桿菌模板均未出現(xiàn)特異性擴增，對應擴增曲線均為平緩直線，而用pMD-19T空質(zhì)粒作的陰性對照及水作的空白對照也均未出現(xiàn)特異性擴增，因此，該方法對膽汁螺桿菌核酸的檢測是特異的（圖4）

2.5 qPCR檢測方法重復性分析

以2×106～2×101copies/μL的模板重復測定5次，分別得到5個Ct值，計算Ct平均值、標準差和變異系數(shù)（表2）。由表2可知，本方法檢測重復性較好。

圖2 pMD-HBP17質(zhì)粒標準品qPCR擴增熒光動力曲線及標準曲線Note：A was fluorescence quantitative amplification plot of10-fold serial dilution standard plasmid；B was standard curve obtained with serial dilution of the pMD-HBP17 standard plasmid from 2×108 copies/well to 2×101 copies/well.Fig.2 Real-time fluorescence quantitative amplification plot and standard curve of pMD-HBP17 standard plasmid

圖3 H.bilis qPCR方法特異性檢測結(jié)果

表2 H.bilis qPCR檢測方法的重復性實驗Tab.2 The repeatability evaluation of 10-fold serial dilution of pMD-HBP17 standard plasmid

2.6 qPCR檢測方法的臨床應用

對送檢的52份SD大鼠盲腸樣品和25份野鼠盲腸樣品進行組織基因組提取后分別用qPCR方法和普通PCR方法檢測樣品中的膽汁螺桿菌，結(jié)果表明，本研究建立的qPCR方法的檢出率為14.3％，而普通PCR方法的檢出率為7.8％，新建立的qPCR方法較普通PCR方法具有更高的檢出率（表3）。

表3 qPCR方法及普通PCR方法檢測膽汁螺桿菌Tab.3 Detection of Helicobacter bilis by qPCR and PCR

3 討論

嚙齒動物螺桿菌為革蘭氏陰性菌，生長要求苛刻，主要寄生于消化道，可導致肝膽疾病，并在肝炎發(fā)生中起促進作用，嚴重影響實驗動物的質(zhì)量［5]。用攜帶嚙齒類螺桿菌的實驗動物進行相關(guān)疾病的發(fā)病機制、藥效學研究、藥品及保健品的安全性評估時，其試驗結(jié)果將受到干擾［6]。膽汁螺桿菌是一種典型而重要的螺桿菌，常以隱性感染形式普遍存在于大鼠、小鼠、沙鼠等嚙齒動物的消化道中，與嚙齒動物肝膽疾病、盲腸炎、結(jié)腸炎等的發(fā)生高度相關(guān)［7-8]。研究指出，膽汁螺桿菌還與人類膽管癌、膽囊炎等腸道疾病的發(fā)生存在相關(guān)性，對人類具有潛在危害性［9]。因此，螺桿菌在實驗動物中的感染已經(jīng)引起國內(nèi)外研究者的高度重視，歐洲實驗動物聯(lián)盟已將其列為實驗動物必須排除的病原菌，但我國因缺乏有效的檢測方法，而尚未被列入實驗動物質(zhì)量國家標準，造成我國實驗動物科研領(lǐng)域與國際水平的差距，進一步影響我國實驗動物產(chǎn)業(yè)化，并對實驗動物進出口帶來不利影響［10]。因此，建立一種簡便、快速、高效、準確的檢測嚙齒類螺桿菌的方法對保證及提高實驗動物質(zhì)量至關(guān)重要。

在螺桿菌檢測方法研究的早期，分離培養(yǎng)法與分子生物學方法因其可靠直接而成為螺桿菌診斷檢測的首選方法，但因螺桿菌的生長條件苛刻，而阻礙了該檢測方法的應用［11]。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，PCR檢測技術(shù)因高效、快速簡便等優(yōu)點而被廣泛應用于檢測螺桿菌。TaqMan探針熒光定量PCR檢測技術(shù)因其特異性好、靈敏度高及可定量等優(yōu)點近年來被廣泛應用于多種病原微生物的檢測［12]。本研究中利用TaqMan探針技術(shù)建立膽汁螺桿菌qPCR檢測方法，可用于膽汁螺的快速檢測及定量。

本研究通過構(gòu)建包含H.bilis P17基因序列的pMD-HBP17質(zhì)粒，作為DNA定量標準品，并對標準品進行倍比稀釋以作為反應模板，驗證該檢測方法的靈敏性。實驗結(jié)果表明模板濃度在108-101拷貝范圍內(nèi)，其相應Ct值具有良好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.999，理論上該檢測方法的定量準確性到達20拷貝。用qPCR方法和既有的普通PCR方法對77份臨床樣品進行檢測，結(jié)果表明qPCR檢測方法較普通PCR方法具有更高的敏感性和檢出率。

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Detection of Helicobacter bilis using quantitative real-time PCR w ith TaqM an probe

WU Miao-li，YUANWen，RAO Dan，ZHU Yu-jun，WANG Jing，YIN Xue-qin，GUO Peng-ju
（Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute，Guangdong Key Laboratory of Laboratory Animals，Guangzhou 510663，China）

Objective To develop a rapid，sensitive and specific assay based on TaqMan probe real-time PCR to quantitate Helicobacter bilis（H.bilis）.Method A 435 bp specific fragment of H.bilis P17 gene was amplified by PCR，then cloned into pMD19-T vector to constructa recombinant plasmid pMD-HBP17，which was used as standard DNA of this qPCR method.The qPCR system was optimized by using serial dilution of standard plasmid.The sensitivity，specificity，repeatability and quantitation range of thismethod were evaluated.The established method was used to detect 77 clinical samples.Result The quantitative standard curve from 108copies/well to 101copies/well of serial diluted plasmid DNAs showed that they had good linear correlation，the slope of the standard curvewas-3.46，R2＞0.999，and the lowest limit reached 2×101copies/well.The positive rate of H.bilis detected by qPCR was 14.3％which is higher than detected by PCR（7.8％）.Conclusion ThisqPCR method showed high sensitivity，specificity and stability and will be utilized for qualitative and quantitative detection of H.bilis.

Helicobacter bilis；QPCR；TaqMan probe

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0059-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.014

國家科技支撐計劃（2013BAK11B01）。

伍妙梨（1987-），女，碩士，研究方向：預防獸醫(yī)學。

郭鵬舉，研究員。E-mial：1517727522@qq.com。

﹞2015-08-18

技術(shù)方法