溶菌酶及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用*

范林林，林楠，馮敘橋，王晶晶，楊文晶，許泰百

1(渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州，121013)2(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)，110866)3(遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州，121001)

溶菌酶(lysozyme，EC 3.2.1.17)是一種專(zhuān)門(mén)作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，因其具有溶菌(細(xì)菌、真菌)作用，故命名為溶菌酶。溶菌酶能夠破壞微生物細(xì)胞壁的N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵，分解不溶性黏多糖為可溶性糖肽，所以又稱(chēng)胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶［1］。除此之外，還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白結(jié)合，與脫輔基蛋白、DNA、RNA合成復(fù)鹽，使病毒失活。溶菌酶來(lái)源較為廣泛，除可從動(dòng)物、植物及微生物中獲得，已有較多基因工程重組溶菌酶(DNA重組)的報(bào)道。根據(jù)來(lái)源不同，可將其分為植物溶菌酶、動(dòng)物溶菌酶、微生物溶菌酶和噬菌體溶菌酶，其中動(dòng)物溶菌酶又可分為C型(雞蛋清溶菌酶)、G型(鵝蛋清溶菌酶)和I型(無(wú)脊椎動(dòng)物溶菌酶)［2］。

1992年FAO/WTO的食品添加劑協(xié)會(huì)公布:溶菌酶應(yīng)用于食品工業(yè)中是安全的，我國(guó)衛(wèi)生部2010年第23號(hào)公告批準(zhǔn)溶菌酶等物質(zhì)為食品添加劑。在食品中，溶菌酶可選擇性地使目標(biāo)微生物細(xì)胞壁溶解，致使內(nèi)容物流出，從而使其失去生理活性，可以安全替代對(duì)人體健康有害的化學(xué)防腐劑，是一種無(wú)毒副作用的天然保鮮劑、安全綠色的添加劑［3］。其中，在食品工業(yè)中主要應(yīng)用于水產(chǎn)品、乳制品、果蔬、肉類(lèi)、酒及飲料的防腐保鮮，不同來(lái)源的溶菌酶的最適作用條件各不相同，因此了解溶菌酶酶學(xué)性質(zhì)對(duì)減少其在食品工業(yè)應(yīng)用中的損失具有較大意義。本文綜述了溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)及其在食品工業(yè)各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用，以期為溶菌酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供重要的基礎(chǔ)參考。

1 溶菌酶的分離純化與改性

1.1 溶菌酶的分離純化方法

為了達(dá)到良好的分離效果，必須根據(jù)來(lái)源的不同，選擇適宜的分離方法。同時(shí)，單一的分離純化方法一般無(wú)法滿足回收率和純度的要求，應(yīng)將兩種或者幾種方法聯(lián)合使用，按照一定的順序進(jìn)行分離，或者建立連續(xù)式的分離體系。由于溶菌酶來(lái)源眾多，其分離純化也有超濾法、親和色譜法、離子交換法和直接結(jié)晶法等多種方法(表1)。隨著新的生物分離技術(shù)的出現(xiàn)，反膠團(tuán)萃取、染料親和色譜、雙水相萃取、親和膜色譜、親和沉淀等分離純化方法也被采用［4］。結(jié)晶法是普遍采用的方法，其中膜結(jié)晶受到越來(lái)越多的關(guān)注，膜結(jié)晶具有結(jié)晶誘導(dǎo)時(shí)間短、結(jié)晶過(guò)程可控、蛋白質(zhì)初始濃度低等優(yōu)點(diǎn)。

雞蛋清中溶菌酶的含量較高，因此目前國(guó)內(nèi)外主要從中提取溶菌酶。傅冰等人采用二次硫酸銨沉淀和離子交換層析透過(guò)法分離溶菌酶，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)其純度，研究雞蛋清中溶菌酶的分離提取工藝，酶活提高超過(guò)15倍，回收率為15.76%，是目前一種高效的提取方法［5］。

1.2 溶菌酶作為天然生物防腐劑的改性研究

天然溶菌酶主要作用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，而對(duì)革蘭氏陰性菌效果不明顯，原因是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中肽聚糖含量很少，并被脂多糖類(lèi)物質(zhì)包裹［6］。為了實(shí)現(xiàn)溶菌酶對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用，需對(duì)天然溶菌酶進(jìn)行改性。

表1 溶菌酶的分離純化方法Table 1 Methods of separation and purification of lysozyme

溶菌酶的改性常通過(guò)化學(xué)修飾或熱改性的方法來(lái)探索和實(shí)現(xiàn)，如果所使用的化學(xué)修飾劑是非食品級(jí)的，則存在安全隱患;熱改性后的溶菌酶可能存在對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的作用降低的問(wèn)題［12］。因此研究學(xué)者常采用超高壓處理，通過(guò)不同的溫度、壓力、施壓方式和保壓時(shí)間改變天然溶菌酶的結(jié)構(gòu)，由表2可知，超高壓能拓寬溶菌酶的抗菌譜，避免了化學(xué)修飾和熱改性的缺點(diǎn)［8］。溶菌酶經(jīng)生物改性后，其抑菌活性增強(qiáng)，擴(kuò)大了溶菌酶的作用范圍(表2)。

表2 天然生物防腐劑溶菌酶的改性研究［6］Table 2 Research progress on modification of lysozyme as natural biological preservative［6］

2 溶菌酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用

在食品工業(yè)中，溶菌酶作為一種無(wú)毒、無(wú)副作用、安全性高的天然蛋白質(zhì)，能選擇性地使目標(biāo)微生物細(xì)胞壁溶解而使其失去生理活性，并且對(duì)食品中的其他營(yíng)養(yǎng)成分影響很小，因此成為食品防腐劑和營(yíng)養(yǎng)保健品的優(yōu)選對(duì)象。溶菌酶的殺菌屬于冷殺菌，可避免高溫殺菌對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味的破壞作用，尤其對(duì)熱敏感的食品更具有重要意義。

2.1 用于水產(chǎn)類(lèi)制品的保鮮和防腐

因溶菌酶具有殺菌、抑菌的作用，近年來(lái)，很多研究學(xué)者研究了溶菌酶對(duì)水產(chǎn)品的防腐保鮮效果，并且取得了良好的成果。表3列舉了溶菌酶在不同水產(chǎn)品中防腐保鮮的應(yīng)用實(shí)例，除此之外，溶菌酶還可作為魚(yú)丸等水產(chǎn)熟制品的保鮮劑，將一定濃度的溶菌酶溶液噴灑在產(chǎn)品上，可起到防腐保鮮的作用;一些新鮮水產(chǎn)品(蝦、蛤蜊肉等)在0.05%的溶酶菌溶液中浸漬5min后，瀝去水分，進(jìn)行低溫貯藏，均可延長(zhǎng)貯存期［7］。

表3 溶菌酶在水產(chǎn)品中的若干應(yīng)用實(shí)例Table 3 Several application examples of in fresh-keeping of aquatics

2.2 在乳制品中的應(yīng)用

溶菌酶是一種非特異性免疫因子，人乳中溶菌酶的含量約是牛乳中的3 000倍，將溶菌酶添加到乳粉中，使牛乳人乳化。據(jù)報(bào)道，溶菌酶對(duì)腸道中腐敗性微生物有殺滅作用，能促進(jìn)嬰兒腸道內(nèi)雙歧桿菌的增殖，促進(jìn)人工喂養(yǎng)嬰兒腸道菌群的正常化，還能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)感染的抵抗力，對(duì)早產(chǎn)嬰兒有預(yù)防消化器官疾病、體重減輕的作用，是配方奶粉及嬰兒食品等的良好食品添加劑。

向乳制品特別是巴氏殺菌奶中添加溶菌酶，能有效延長(zhǎng)其保存期，一般在包裝前加入300～600 μg/mL;另外，由于溶菌酶具有一定的耐高溫性，因而也可被用于高溫瞬間殺菌奶中。郭慶啟等［13］人報(bào)道了溶菌酶經(jīng)固定化后耐熱性提高、耐酸性增強(qiáng);固定化后的溶菌酶與底物殼聚糖的親和力下降，重復(fù)使用5次時(shí)，酶活力殘留率為57.6%。在奶酪加工中添加一定量的溶菌酶可以防止中后期奶酪的起泡、風(fēng)味變差，并且對(duì)奶酪老化過(guò)程中奶酪基液的品質(zhì)不造成影響，同時(shí)還能起到較好的抑菌作用，不至引起酪酸發(fā)酵，有效防止由于丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium tyrobutyricum)污染發(fā)酵奶酪中的乳酸鹽而產(chǎn)氣或“后期的開(kāi)裂”現(xiàn)象。此外，還能利用溶菌酶生產(chǎn)酵母浸膏和核酸類(lèi)調(diào)味品。溶菌酶還可作為防腐劑用于蛋糕、奶油等極易腐敗變質(zhì)的食品中。據(jù)報(bào)道轉(zhuǎn)基因羊能夠產(chǎn)生富含溶菌酶的奶，溶菌酶含量可達(dá)到270mg/L，占人乳的67%。

2.3 在肉制品中的應(yīng)用

溶菌酶與EDTA聯(lián)合應(yīng)用在火腿、臘腸及其他肉制品等中，已取得了較好的協(xié)同保鮮效果。溶菌酶對(duì)于控制冷鮮肉的細(xì)菌總數(shù)的增殖、減緩TVB-N值的上升方面也具有明顯效果，GNa液、Nisin、溶菌酶三者配合處理冷鮮肉，取得了非常理想的保鮮效果［14］;張杰等［15］人研究表明，0.75 g/L乳酸鏈球菌肽、1.0 g/L溶菌酶及2.0 g/L殼聚糖保鮮劑結(jié)合真空包裝對(duì)兔肉的保鮮效果較好，可使其在0～4℃冷藏條件下保鮮期達(dá)至27 d。Huang等［16］人研究了溶菌酶、殼聚糖及有機(jī)累托石復(fù)合涂膜對(duì)豬肉保鮮效果的影響，結(jié)果表明，能夠有效抑制大腸桿菌和黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖，保存豬肉至21 d左右。

2.4 在果蔬產(chǎn)品中的應(yīng)用

近年來(lái)，溶菌酶也廣泛應(yīng)用于果蔬的防腐保鮮中，并且起到了良好的保鮮效果。表4列舉了近幾年溶菌酶及溶菌酶與其他物質(zhì)配伍應(yīng)用于果蔬保鮮中的若干實(shí)例。除此之外，溶菌酶對(duì)豆豉和四川泡菜等熱敏感的發(fā)酵食品具有防腐抑菌作用，可有效地抑制發(fā)酵食品發(fā)生褐變，維持原有色澤，還可極明顯地減少食鹽用量，降低泡菜和豆瓣的咸味，提高產(chǎn)品風(fēng)味，同時(shí)避免了高溫殺菌對(duì)這類(lèi)食品風(fēng)味的破壞作用。此外，Kerkaert等［17］人使用溶菌酶作為一種蛋白質(zhì)的指示劑，來(lái)檢測(cè)鮮切蔬菜中過(guò)敏蛋白質(zhì)的行為。

表4 溶菌酶在果蔬貯藏中的若干應(yīng)用實(shí)例Table 4 Several application examples of in fresh-keeping of fruit and vegetables

2.5 在保健功能性食品中的應(yīng)用

溶菌酶具有一定的保健作用，有抗感染和增強(qiáng)抗生素作用效力，促進(jìn)血液凝固及止血，促進(jìn)組織再生和瘢痕形成等作用。因此，可以在保健食品中添加一定量以提高保健效果。研究報(bào)道了在飼養(yǎng)肉雞中用溶菌酶代替氧氟沙星、磺胺類(lèi)、氟苯尼考等化學(xué)保健品，結(jié)果表明，溶菌酶組出欄用藥成本、雞群總重和死亡率等均顯示較好效果。此外，醫(yī)學(xué)上，若在牙膏、漱口水、口腔清潔劑、口香糖中設(shè)法添加一定量的溶菌酶，可以殺死導(dǎo)致蛀牙的病菌，達(dá)到預(yù)防蟲(chóng)牙的目的。

2.6 在食品包裝材料中的應(yīng)用

目前有關(guān)溶菌酶在包裝材料上應(yīng)用的理論研究較多，即將溶菌酶固定在食品包裝材料上，生產(chǎn)出有抗菌功效的食品包裝材料，延長(zhǎng)食品貨架期。目前許多肉制品軟包裝都要進(jìn)行高溫滅菌處理，經(jīng)此處理后的肉制品脆性變差甚至產(chǎn)生蒸煮味，影響消費(fèi)量;如果在肉制品真空包裝前添加一定量的溶菌酶(1%～3%)，然后巴氏殺菌(80～100 ℃，25～30 min)，可獲得很好的保鮮效果，避免了高溫滅菌帶來(lái)的負(fù)面影響。同樣，果蔬加工前添加一定量的溶菌酶，一般添加量為0.1% ～0.2%(拌料時(shí)添加)或1% ～3%(加熱煮制時(shí)添加)，也能起到很好的保鮮效果。Gemili等［23］人研究了溶菌酶固定在醋酸纖維酯包裝材料上，能夠有效維持溶菌酶的活性，提高溶菌酶的抗菌活性。Corradini等［24］人報(bào)道了溶菌酶結(jié)合溶膠技術(shù)制成抗菌膜，研究了其抗菌活性，結(jié)果表明了該處理能夠有效地抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖。杜會(huì)云等［25］人證實(shí)了添加殼聚糖、溶菌酶和牛至油的大豆分離蛋白膜對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母和黑曲霉等微生物均有顯著的抑制作用。用蛋清溶菌酶配制的2%～3%酶液，噴灑于包裝紙上或浸入酶液(2～3 h)，烘干，包裝煮熟的大豆、饅頭，貯藏1周不變味，而用普通紙包裝的這些食品貯藏1 d就會(huì)發(fā)黏變味。

2.7 溶菌酶的其他作用

溶菌酶是低度酒的理想防腐劑，可防止低度酒中酸菌的繁殖生長(zhǎng)，不影響酒的風(fēng)味，溶菌酶已應(yīng)用于純生啤酒中［26］;溶菌酶還可應(yīng)用于飲料(pH 6.0～7.5)的防腐，果汁和料酒中也有應(yīng)用。在生面條、花生醬和色拉等食品中加入溶菌酶，也可起到良好的保鮮效果。溶菌酶在家禽飼料中使用，可降低發(fā)病率，能提高血清中溶菌酶含量和免疫功能。溶菌酶固定在空氣過(guò)濾器上，可作為空調(diào)的空氣凈化系統(tǒng)，使其具有高效除塵、殺菌兩大功能。溶菌酶在化妝品中也應(yīng)用。

利用溶菌酶處理革蘭比陽(yáng)性細(xì)菌還可得到原生質(zhì)體，因此，溶菌酶也是基因工程、細(xì)胞工程中細(xì)胞融合操作必不可少的工具酶。溶菌酶與免疫球蛋白的功能緊密聯(lián)系，可進(jìn)入機(jī)體增強(qiáng)抗體活性，從而殺滅有害微生物，溶菌酶對(duì)引起仔豬腹瀉的埃希氏大腸桿菌和輪狀病毒都具有較強(qiáng)的抑制作用。用溶菌酶非專(zhuān)一性地降解海洋生物高分子殼聚糖，使其成為能被人體吸收的、低分子質(zhì)量的、有獨(dú)特的生理活性和功能性質(zhì)的低聚殼聚糖。因此，開(kāi)發(fā)溶菌酶具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

3 溶菌酶與其他技術(shù)結(jié)合的應(yīng)用研究

隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，各種高效、安全的食品保鮮技術(shù)層出不窮。將溶菌酶與其他保鮮技術(shù)結(jié)合，能夠使食品在加工和貯藏時(shí)取得良好的防腐保鮮效果。

3.1 溶菌酶與輻照保鮮技術(shù)

食品輻照保鮮已被證明是一種高效、安全的加工手段。水產(chǎn)品腐敗菌中大部分是革蘭氏陰性菌，該菌對(duì)射線較為敏感，國(guó)外關(guān)于冰鮮魚(yú)的輻照保鮮研究得出，輻照劑量為1kGy即可起到很好的保鮮作用［27］。較低溫度時(shí)輻照出口冷凍蝦仁，可降低輻照劑量，且保鮮效果較好。因此，將溶菌酶、輻照及與低溫協(xié)同保鮮可以進(jìn)行嘗試研究，且輻照對(duì)溶菌酶抑菌活性是否有促進(jìn)或是抑制作用可成為研究重點(diǎn)。

3.2 溶菌酶與高壓超聲波處理技術(shù)

Gomez等［28］研究發(fā)現(xiàn)，在 300 MPa 的水壓下，冷凍煙熏鲯鰍肉片的感官品質(zhì)是最佳的，且減少貯藏前期微生物的含量。據(jù)Nakimbugwe［29］等報(bào)道:在相同的超高壓處理下，溶菌酶為食品防腐提供了另一個(gè)屏障。食品經(jīng)過(guò)超高壓超聲波(manosonication，MS)雙道處理，可提高枯草芽孢桿菌的芽孢對(duì)溶菌酶的敏感性，并且推斷超聲波處理可以破壞芽孢外層，降低其耐熱性。

3.3 溶菌酶與氣調(diào)包裝技術(shù)

氣調(diào)包裝(MAP)技術(shù)是目前流行的一種無(wú)防腐劑或低防腐劑量的包裝技術(shù)。Fernandez等［12］將溶菌酶與氣調(diào)包裝結(jié)合，能使大西洋鮭魚(yú)片的貨架期延長(zhǎng)，其保鮮效果優(yōu)于單一的溶菌酶處理組。謝晶等［30］人將復(fù)合生物保鮮劑(1.0%殼聚糖+0.4%茶多酚)結(jié)合氣調(diào)包裝，處理帶魚(yú)，既延長(zhǎng)了貨架期，又能較好維持感官品質(zhì)，取得了良好的保鮮效果。溶菌酶結(jié)合高壓CO2可使酸土脂環(huán)酸桿菌芽孢核心物質(zhì)2，6-吡啶二羧酸(DPA)發(fā)生大量泄露，且部分芽孢完全破裂，因此溶菌酶與高壓CO2殺滅芽孢的協(xié)同效果較好［31］。

4 溶菌酶應(yīng)用中所存在的問(wèn)題

目前我國(guó)提取的溶菌酶的純度和活性遠(yuǎn)不如國(guó)外的，溶菌酶提取技術(shù)需要深入研究。溶菌酶的高端產(chǎn)品主要被美國(guó)、加拿大等國(guó)公司壟斷，我國(guó)只能作為粗品原料出口，而且高端產(chǎn)品還要依賴(lài)進(jìn)口，這些事實(shí)嚴(yán)重阻礙了我國(guó)溶菌酶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。一些學(xué)者通過(guò)物理、化學(xué)或生物的方法對(duì)溶菌酶進(jìn)行改性研究，以期獲得對(duì)G－菌較好的抑制或滅菌效果。溶菌酶經(jīng)化學(xué)改性后，酶的空間構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，但是尚不能準(zhǔn)確解釋其結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系此外，如果所使用的化學(xué)修飾劑屬非食品級(jí)，則化學(xué)修飾后的溶菌酶在食品領(lǐng)域使用的安全性，有待進(jìn)一步研究證明。

另外，溶菌酶作為酶類(lèi)生物保鮮劑，需在適宜的溫度、pH、水分等條件下，才能發(fā)揮較大的活性。而一些水產(chǎn)品及肉產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中一般會(huì)有高溫殺菌工序;且一般進(jìn)行低溫保藏，這兩種操作極有可能使得溶菌酶的抑菌效果較差。熱變性的溶菌酶，雖然喪失了酶活，但仍可對(duì)多種細(xì)菌和真菌表現(xiàn)出抗菌活性，例如T4溶菌酶，溶菌酶的抑菌活性與酶活之間的關(guān)系有待考究。此外，溶菌酶具有專(zhuān)一性，單一使用溶菌酶對(duì)酵母、霉菌引起的腐敗變質(zhì)不能起到很好的保鮮作用，應(yīng)使用復(fù)合生物保鮮劑。溶菌酶對(duì)動(dòng)物腸道菌群的影響缺乏具體的研究報(bào)道，影響了其作為營(yíng)養(yǎng)功能食品添加劑的推廣應(yīng)用。不同來(lái)源的溶菌酶對(duì)產(chǎn)品的保鮮效果是否具有協(xié)同作用等也需進(jìn)一步考究。

5 展望

隨著產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的日趨激烈，發(fā)展綠色、安全、優(yōu)質(zhì)、高效的產(chǎn)品將是食品工業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)，其中溶菌酶滿足了這一需求，目前，有關(guān)溶菌酶的研究熱點(diǎn)是除了殺菌功能以外的其他未知生物學(xué)作用，其次是有關(guān)人溶菌酶的應(yīng)用研究。人溶菌酶通常是從人乳或胎盤(pán)中少量提取，然而來(lái)源困難，提取方法復(fù)雜，因此不能進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，采用基因工程技術(shù)，從細(xì)菌或酵母中生產(chǎn)人溶菌酶是解決其供需矛盾的主要途徑。人溶菌酶參與機(jī)體的防御機(jī)制，有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，前景是可觀的。通過(guò)基因工程途徑生產(chǎn)溶菌酶可較大程度地降低成本，以推動(dòng)其在醫(yī)藥業(yè)、食品工業(yè)、畜牧業(yè)等領(lǐng)域中的應(yīng)用。

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