肖志軍，郭潔文，徐 峰（.上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海 0400；.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣州 5030）

?論著?

荔枝核皂苷和荔枝核黃酮對HepG2細胞胰島素抵抗作用研究

肖志軍1，郭潔文2，徐 峰1（1.上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海 201400；2.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣州 510130）

目的探討荔枝核皂苷、荔枝核黃酮對胰島素抵抗HepG2細胞糖代謝的影響。方法采用高濃度胰島素培養(yǎng)基誘導HepG2細胞形成胰島素抵抗模型，葡萄糖氧化酶法測定對照組、荔枝核皂苷組、荔枝核黃酮組、羅格列酮組細胞培養(yǎng)上清液中的葡萄糖含量，觀察荔枝核皂苷、荔枝核黃酮對HepG2細胞胰島素抵抗的作用。結果HepG2細胞在10－6mol／L的胰島素中作用24 h，細胞對胰島素的抵抗作用最為明顯。以此條件構建胰島素抵抗細胞模型，對該模型給予荔枝核皂苷、荔枝核黃酮干預后，細胞培養(yǎng)上清液中葡葡糖含量未能顯著降低。結論本研究提示荔枝核皂苷、荔枝核黃酮不能有效改善胰島素抵抗。

荔枝核皂苷；荔枝核黃酮；胰島素抵抗；HepG2細胞

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是指胰島素敏感組織如肝、脂肪、骨骼肌等受胰島素介導的葡萄糖攝取和利用能力減弱的一種病理和生理狀態(tài)［1］。IR是高血壓、2型糖尿病和脂肪肝、肥胖等代謝性疾病并發(fā)和相互聯(lián)系的病理學基礎。中藥具有多成分、多作用靶點的優(yōu)勢，可能通過不同的途徑和環(huán)節(jié)來改善IR［2］。因此，尋找、研究改善IR的中藥日益被重視。

荔枝核為無患子科植物荔枝（Litchi chinensis Soon.）的干燥成熟種子，其活性成分主要有總皂苷、黃酮、多糖、多酚等。本課題組前期研究表明［3-7］，荔枝核水提取物對高糖、高脂飲食加低劑量鏈脲霉素誘導的T2DM-IR動物模型，荔枝核總皂苷對高糖、高脂飲食誘導高脂血癥-IR-脂肪肝與地塞米松致IR兩種動物模型均有顯著的降糖、調脂和改善IR作用。

因此，為深入研究荔枝核改善IR的作用機制，本實驗擬采用超生理濃度的胰島素刺激人肝癌細胞HepG2，建立具有IR特點的細胞模型，進一步觀察在細胞形成IR的情況下，荔枝核提取物皂苷和黃酮能否有效改善IR細胞模型的葡萄糖利用和攝取。

1 材料與方法

1.1 細胞株 HepG2細胞株購自中科院上海細胞庫。

1.2 藥品與試劑 荔枝核皂苷和荔枝核黃酮由中國熱帶農業(yè)科學院農產(chǎn)品加工研究所林麗靜博士分離并提供樣品。DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（Biochrom公司），0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液、青霉素-鏈霉素混合液（Hyclone公司），胰島素、羅格列酮標準品、MTT、DMSO（Sigma公司），葡萄糖測定試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）。

1.3 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司），超凈工作臺（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），酶標儀（美國Biotek公司），倒置顯微鏡（德國Leica公司），高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞HepG2在添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)。HepG2細胞為貼壁細胞，當細胞長滿瓶底后，棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗2次，0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3比例進行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.4.2 HepG2胰島素抵抗細胞模型的建立 參考文獻［8］方法并加以改進。將處于對數(shù)生長期的細胞消化后，用含2%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基調整細胞密度為1×106／L，接入96孔細胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，分為對照組和模型組。待細胞貼壁長至80%后，模型組加入新配制的含胰島素濃度為10－5、10－6、10－7、10－8mol／L的培養(yǎng)基，對照組加入正常培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育36 h后，用葡萄糖氧化酶法測定細胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量。計算對照組與不同胰島素濃度組細胞的葡萄糖含量消耗差值，選擇葡萄糖消耗差值最大，即達到胰島素抵抗最高狀態(tài)的胰島素作用濃度為胰島素最佳濃度。

確定胰島素最佳濃度后，重復上述方法，模型組加入新鮮配制的含有胰島素最佳濃度的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)12、24、36和48 h，對照組加入正常培養(yǎng)基。計算對照組和模型組細胞的葡萄糖消耗量差值。選擇葡萄糖消耗量差值最大，即達到胰島素抵抗最高狀態(tài)的胰島素作用時間為胰島素作用的最佳時間。通過分別確定最佳胰島素濃度和最佳作用時間后，建立最適宜的胰島素誘發(fā)的HepG2胰島素抵抗細胞模型。

1.4.3 M TT法篩選荔枝核皂苷、荔枝核黃酮工作濃度 建立HepG2胰島素抵抗細胞模型后，將細胞接種于96孔板，每孔約5 000個細胞。實驗設荔枝核皂苷組、荔枝核黃酮組、對照組。荔枝核皂苷組、荔枝核黃酮組分別加入濃度為0.01、0.1、1、10、50、100 mg／L的荔枝核皂苷和荔枝核黃酮，對照組加入正常培養(yǎng)基，各實驗組中DMSO的終濃度均＜0.1%。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每孔加入20μl濃度為5 mg／m l的M TT溶液，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。棄上清液，各孔分別加入100μl的DMSO，微型振蕩器振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀于波長490 nm處測各孔吸光度（A）。細胞存活率＝（藥物組A／對照組A）×100%。

1.4.4 荔枝核皂苷和荔枝核黃酮對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響 建立HepG2胰島素抵抗細胞模型后，將細胞接種于96孔板，每孔約5 000個細胞。實驗設HepG2胰島素抵抗細胞模型組、羅格列酮組（終濃度為10－5mol／L）、荔枝核皂苷組和荔枝核黃酮組。各組加入相應的藥物后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用葡萄糖氧化酶法測定細胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多樣本均數(shù)差的多重比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同胰島素濃度對HepG2細胞胰島素抵抗的影響 從表1可以看出，與對照組相比，胰島素濃度為10－5、10－6、10－7mol／L時HepG2細胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量增加（P＜0.05）。且在胰島素濃度為10－6mol／L時葡萄糖含量最高，即葡萄糖消耗量最小，達到最大胰島素抵抗狀態(tài)。因此，選擇10－6mol／L為最佳胰島素濃度，建立HepG2胰島素抵抗細胞模型。

表1 不同濃度胰島素對HepG2細胞胰島素抵抗的影響（n＝6，±s）

表1 不同濃度胰島素對HepG2細胞胰島素抵抗的影響（n＝6，±s）

*P＜0.05，與對照組比較

組別胰島素含量（c B／mol?L－1）葡萄糖含量（c B／mol?L－1）對照組0 19.694±0.632胰島素組10－521.091±0.215*10－622.459±0.249*10－720.407±0.245*10－819.884±0.280

2.2 胰島素不同作用時間對HepG2細胞胰島素抵抗的影響 從表2可以看出，與對照組相比，胰島素作用時間為24、36、48 h時，HepG2細胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量增加（P＜0.05）。在胰島素作用24 h時，胰島素抵抗與對照組比較差異顯著（P＜0.01）。此外，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞狀態(tài)逐漸變差。因此，選擇10－6mol／L胰島素處理HepG2細胞24 h為建模條件，建立胰島素抵抗HepG2細胞模型。

表2 胰島素不同作用時間對HepG2細胞胰島素抵抗的影響（n＝6，±s）

表2 胰島素不同作用時間對HepG2細胞胰島素抵抗的影響（n＝6，±s）

*P＜0.05，與對照組比較；**P＜0.01，與對照組比較

組別葡萄糖含量（cB／mol?L－1）12 h 24 h 36 h 48 h對照組21.950± 0.549 18.882± 0.097 18.696± 0.111 18.584± 0.124 10－6mol／L胰島素組22.260± 0.185 21.852± 0.634**20.493± 0.193*18.815± 0.169*

2.3 M TT實驗篩選荔枝核皂苷的工作濃度 由圖1可知，HepG2細胞存活率隨著荔枝核皂苷的濃度增加而降低，當荔枝核皂苷濃度為50 mg／L時，細胞存活率為（99.44±5.692）%，表明此時當荔枝核皂苷對HepG2細胞生長開始產(chǎn)生抑制作用，為了消除因抑制細胞生長而對葡萄糖消耗量產(chǎn)生的影響，本實驗選取50、10、1 mg／L為荔枝核皂苷的工作濃度。

圖1 不同濃度荔枝核皂苷對HepG2細胞存活率的影響（n＝6，±s）

2.4 M TT實驗篩選荔枝核黃酮的工作濃度 由圖2可知，當荔枝核黃酮濃度為50、100 mg／L時，HepG2細胞存活率分別為（101.97±7.963）%、（82.38±8.374）%，為了消除因抑制細胞生長而對葡萄糖消耗量產(chǎn)生的影響，本實驗選取50、10、1 mg／L為荔枝核黃酮的工作濃度。

2.5 荔枝核皂苷對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響 由圖3可知，與對照組相比，荔枝核皂苷濃度為50 mg／L時細胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量增加，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。羅格列酮組能夠提高葡萄糖消耗量，即具有降血糖作用。

圖2 不同濃度荔枝核黃酮對HepG2細胞存活率的影響（n＝6，±s）

圖3 不同濃度荔枝核皂苷對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響（n＝6，±s）

2.6 荔枝核黃酮對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響 由圖4可知，與對照組相比，經(jīng)3個濃度荔枝核黃酮處理后的細胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量有所降低，但差異均無統(tǒng)計學意義。羅格列酮能夠顯著提高胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量，即有降血糖作用。

圖4 不同濃度荔枝核黃酮對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響（n＝6，±s）

3 討論

2型糖尿病的發(fā)病機制主要是胰島β細胞功能障礙和外周組織產(chǎn)生IR，改善IR是治療2型糖尿病的主要研究方向之一［9，10］。肝臟是產(chǎn)生IR的主要組織，胰島素從胰島細胞分泌后，經(jīng)門靜脈約一半以上被肝攝取。本實驗采用的HepG2細胞為人的肝胚胎瘤細胞，保留肝的一般生物學特性［10］。通過采用高于生理濃度的胰島素誘導HepG2細胞，在一定程度上模擬了IR的自然發(fā)病過程。本實驗結果提示，應用高胰島素誘導培養(yǎng)法可使HepG2細胞胰島素刺激的葡萄糖消耗量減少，即發(fā)生IR。

本實驗在成功建立IR HepG2細胞模型基礎上進行，通過測定藥物干預后細胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量來判定荔枝核皂苷和荔枝核黃酮改善HepG2細胞IR的作用。從實驗結果來看，荔枝核皂苷和荔枝核黃酮體外并無明顯降糖作用。

以往的研究表明，荔枝核降糖的主要功效成分為皂苷［5］、多糖［11］和氨基酸［12］。其中，荔枝核皂苷主要是通過促進外周組織尤其是肌肉、脂肪組織對葡萄糖的攝取、酵解和利用，提高對胰島素的敏感性，拮抗胰高血糖作用，從而產(chǎn)生降血糖作用［13］。而本研究的結果卻表明荔枝核皂苷體外并無明顯降糖作用，基于此，我們認為荔枝核皂苷改善IR的作用部位可能并非位于肝細胞，而是位于肌肉和脂肪等其他外周組織。

本課題組一項對荔枝核有效部位群改善3T3-L1脂肪細胞IR作用的研究表明，荔枝核有效部位群能夠顯著改善IR［14］。雖然本實驗在進一步對荔枝核化學成分進行細致研究發(fā)現(xiàn)，荔枝核皂苷不能改善IR，荔枝核黃酮類改善IR作用并不明顯，但這樣的結果更加提示我們，中藥材的藥效恰恰是一個整體的效應，正所謂“每一味中藥都是一個小復方”。中藥有效部位群的作用與進一步細分下去的化學成分的作用可能難以完全一致，單一化學成分的藥理活性難以體現(xiàn)有效部位群的作用，與有效部位群的功能主治也不盡相同。構成有效部位群的每個化學組分，若離開其所在的特定物質群或特定復方環(huán)境，則失去其意義。因此，對荔枝核降糖作用的研究，或進一步推廣到對中藥的研究，應著眼于有效部位群。

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Effect of litchi saponin and litchi flavones on insulin resistance in HepG 2 cells

XIAO Zhijun1，GUO Jiewen2，XU Feng1（1.Department of Pharmacy，F(xiàn)engxian Central Hospital，Shanghai 201400，China；2.Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510130，China）

ObjectiveTo study the effect of litchisaponin and flavones on glycometabolism in insulin resistancemodelof HepG2 cells.MethodsUsing high insulin in HepG2 cells to establish a cellmodelof insulin resistance.Cellmodelwas treated by litchisaponin，litchi flavones and rosiglitazone，respectively.Glucose concentration of cell culture supernatantwas detected by glucose oxidasemethod.ResultsIn the concentration of 10－6mol／L insulin for 24 hours，HepG2 reached the highest level of resistant to insulin，whichmeans a successful insulin resistance cellmodelwas established.However，no significant decrease in glucose concentration of cell culture supernatantwas observed w ith litchisaponin and flavones.ConclusionThis study suggests that litchi saponin and flavones have no effect to improve insulin resistance.

litchi saponin；litchi flavones；insulin resistance；HepG2 cells

R285

A

1006-0111（2015）04-0316-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.04.007

2015-04-22

2015-06-06［本文編輯］李睿旻

上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研基金（No.2012Y010A）

肖志軍，藥師.研究方向：中藥藥理學.E-mail：zhijxiao＠163.com

徐 峰，主任藥師.研究方向：臨床藥理學.Tel（021）57422032；E-mail：andrew fxu＠sina.com