張潔 邢青 王甦民 易俊莉 楊新宇 丁北川 蘇建榮

?

·論著·

傳統(tǒng)培養(yǎng)法與PCR-熒光探針法鑒定分枝桿菌的對比研究

張潔 邢青 王甦民 易俊莉 楊新宇 丁北川 蘇建榮

目的 比較傳統(tǒng)培養(yǎng)法和PCR-熒光探針法在分枝桿菌的鑒定中有無差異。方法 對1552 株分枝桿菌臨床分離株同時(shí)用傳統(tǒng)培養(yǎng)法對硝基苯甲酸(PNB)、噻吩二羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基生長試驗(yàn)及PCR-熒光探針法進(jìn)行鑒定，結(jié)果有差別的菌株用16SrRNA基因測序的方法進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果 兩種方法非結(jié)核分枝桿菌的符合率為75.4%(46/61)，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的符合率為99.0%(1491/1506)，總體符合率為99.0%(1537/1552)。兩種方法檢測結(jié)果不同的15株樣本經(jīng)16SrRNA基因測序進(jìn)行鑒定，PCR-探針法與16SrRNA結(jié)果一致的有14株，另外1株經(jīng)傳代分離純化后測序結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌和戈登分枝桿菌的混合菌。非結(jié)核分枝桿菌對PNB培養(yǎng)基的敏感度為21.7%(13/60)，有0.1%(1/1492)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群對PNB表現(xiàn)耐受性。對PNB敏感的13株非結(jié)核分枝桿菌中，有76.9%(10/13)為堪薩斯分枝桿菌。結(jié)論 部分非結(jié)核分枝桿菌使用PNB-TCH生長試驗(yàn)進(jìn)行鑒定時(shí)會出現(xiàn)誤判，而PCR-熒光探針法鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌的準(zhǔn)確性較高。

非結(jié)核分枝桿菌； 結(jié)核分枝桿菌； 細(xì)菌學(xué)技術(shù)； 聚合酶鏈反應(yīng)； 對比研究

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculosis mycobacteria, NTM)是分枝桿菌屬內(nèi)除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌外的其他分枝桿菌的統(tǒng)稱，是一類具有獨(dú)特生物學(xué)特征，在形態(tài)、染色等性狀方面類似結(jié)核分枝桿菌的不典型抗酸桿菌。2010年第五次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，NTM的分離率為22.9%[1]；NTM對大多數(shù)抗結(jié)核藥物呈天然耐藥性,因此，NTM病的早期診斷，對指導(dǎo)臨床開展有效化療意義重大。當(dāng)前，實(shí)驗(yàn)室區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTBC)與NTM，主要的生物表型鑒定方法之一是對硝基苯甲酸-噻吩二羧酸肼 (PNB-TCH)培養(yǎng)基生長試驗(yàn)，該方法是根據(jù)PNB在500 μg/ml的濃度下選擇性抑制MTBC生長，而不抑制大多數(shù)NTM的生長來做區(qū)分，一般需要28 d才能給出報(bào)告。分子生物學(xué)理論及技術(shù)特別是以PCR為基礎(chǔ)的分子鑒定技術(shù)的快速發(fā)展，為分枝桿菌分類鑒定開辟了新的途徑。熒光定量PCR采用雙重PCR技術(shù)和Taqman探針技術(shù)相結(jié)合，對分枝桿菌中提取的分枝桿菌核酸進(jìn)行定性檢測，分別針對MTBC和分枝桿菌的特異性序列設(shè)計(jì)引物和探針，兩個(gè)探針分別標(biāo)記不同的熒光發(fā)光基團(tuán)，檢測時(shí)，當(dāng)反應(yīng)體系中有目的基因存在時(shí)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，就會釋放出熒光，通過檢測不同熒光通道的熒光信號變化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對MTBC和NTM的鑒別,方法簡便、快速，1個(gè)工作日可獲得結(jié)果。

材料和方法

一、菌株和實(shí)驗(yàn)材料

1. 菌株：本研究所用的1552株臨床分離株均由北京市結(jié)核病控制研究所菌株庫提供，涂片均為抗酸染色陽性菌株。胞內(nèi)分枝桿菌(ATCCl3950)、堪薩斯分枝桿菌(ATCCl2478)、戈登分枝桿菌(ATCCl4470) 3種NTM的標(biāo)準(zhǔn)株及結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(H37Rv)均由國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

2. 材料：分枝桿菌培養(yǎng)管均由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。中性羅氏培養(yǎng)管批號為20140429；含PNB的羅氏培養(yǎng)管批號為20140514；含TCH的羅氏培養(yǎng)管批號為20140506。分枝桿菌核酸檢測試劑盒(批號為20080703)由博奧生物有限公司提供；核酸提取儀為博奧生物有限公司ExtractorTM36；低溫高速離心機(jī)為德國Sigma 3K15；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為羅氏480。

二、試驗(yàn)方法

1.復(fù)活菌株庫中的1552株分枝桿菌臨床分離株：將菌株庫中的菌株從-80 ℃超低溫冰箱轉(zhuǎn)移到-40 ℃超低溫冰箱1周后，從-40 ℃超低溫冰箱轉(zhuǎn)移到-20 ℃超低溫冰箱；擱置1周后，再從-20 ℃冰箱轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱保存。從凍存管中用加樣槍吸取100 μl菌液轉(zhuǎn)種于中性羅氏培養(yǎng)管中，在培養(yǎng)管上記錄菌株的庫號、患者姓名及接種日期，37 ℃孵育，每周觀察1次生長狀態(tài)，直至菌落長出。若培養(yǎng)4周還未長出，則重新吸取菌液傳代，同時(shí)放入28 ℃、37 ℃孵箱孵育，直至菌落長出。

2.菌種生物表型鑒定：所有菌株均按照文獻(xiàn)[2]，使用含PNB和含TCH的羅氏培養(yǎng)管鑒定區(qū)分MTBC和NTM。取培養(yǎng)的陽性分枝桿菌菌株的菌懸液0.1 ml分別接種到含PNB和含TCH的羅氏培養(yǎng)管及對照管(普通羅氏培養(yǎng)基)中，36 ℃恒溫培養(yǎng)4周，如對照管中分枝桿菌生長良好，則報(bào)告菌種初步鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果；如果在對照管中沒有生長，則需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。TCH陽性、PNB陰性定為MTBC；TCH陽性、PNB陽性定為NTM。

3. PCR-熒光探針法：(1)核酸的提取：在核酸提取管中加入50 μl核酸提取液，再加入30 μl菌液，放入核酸提取儀，最大轉(zhuǎn)速振蕩5 min后95 ℃水浴5 min，3000×g離心2 min后放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?2)PCR擴(kuò)增：配制擴(kuò)增反應(yīng)液，冰上放置，每個(gè)標(biāo)本取2 μl(盡量吸取上層液體核酸)，加入PCR擴(kuò)增體系，將PCR管放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，設(shè)置擴(kuò)增程序：37 ℃ 300 s、94 ℃ 180 s后，94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)，50 ℃ 10 s。同時(shí)選擇FAM和VIX通道，熒光采集點(diǎn)選擇60 ℃ 30 s。(3)結(jié)果的判定：PCR結(jié)束后，根據(jù)樣品的循環(huán)閾值(Ct值)及擴(kuò)增曲線判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌和(或)非結(jié)核分枝桿菌。FAM通道陽性，VIC通道陰性或者陽性，均為MTBC；FAM通道陰性，VIC通道陽性，為NTM；FAM通道陰性，VIC通道陰性，無分枝桿菌。

4. 基因測序:兩種方法檢測結(jié)果不同的菌株，經(jīng)傳代分離純化后提取核酸送至北京中科希林生物有限公司對16S rRNA基因測序，引物序列為：5′-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3′，5′-AG-CGTGCGGGCGATACGGGC-3′；測序結(jié)果與文庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對確定菌種類型。

5. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法：兩種方法檢測結(jié)果使用配對四格表資料χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.PNB-TCH生長試驗(yàn)與PCR-探針法檢測結(jié)果：1552株培養(yǎng)陽性菌株中，PNB-TCH生長試驗(yàn)檢出48株NTM，1504株MTBC，NTM分離率為3.1%(48/1552)；PCR-探針法檢出59株NTM，1493株MTBC，NTM分離率為3.8%(59/1552)；兩種方法檢測結(jié)果不一致的菌株一共有15株。檢測結(jié)果顯示，NTM符合率為75.4%(46/61)，MTBC符合率為99.0%(1491/1506)，總體符合率為99.0%(1537/1552)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.66，P<0.05) (表1)。

表1 臨床菌株兩種方法檢測結(jié)果的比較(株)

2. 16S rRNA基因測序檢測結(jié)果：以廣泛應(yīng)用的分枝桿菌核酸16SrRNA序列分類方法為標(biāo)準(zhǔn)，對PCR-探針法與PNB-TCH生長試驗(yàn)結(jié)果不同的15株樣本進(jìn)行驗(yàn)證:其中，PCR-探針法與16S rRNA測序結(jié)果一致者有14株；1個(gè)樣本經(jīng)傳代分離純化后測序結(jié)果顯示，樣本中包括結(jié)核分枝桿菌和戈登分枝桿菌 (表2)。NTM對PNB培養(yǎng)基的敏感度為21.7%(13/60)，有0.1%(1/1492)的MTBC對PNB產(chǎn)生耐受性；對PNB敏感的13株NTM中，有76.9%(10/13)為堪薩斯分枝桿菌。

表2 15株分枝桿菌菌型鑒定結(jié)果

討 論

近年來，隨著實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)室鑒定出NTM的菌株逐年增加，導(dǎo)致文獻(xiàn)報(bào)道的NTM病數(shù)量呈上升趨勢[3]。眾所周知，NTM導(dǎo)致的肺部疾病在痰涂片、胸部影像學(xué)等常規(guī)檢測方面無法與MTBC區(qū)分, 但MTBC與NTM在治療方案上存在巨大差異。近期的報(bào)道顯示，NTM對任何一種抗結(jié)核藥物不敏感度達(dá)95.5%[4]，在沒有進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果的情況下，一些NTM患者會因誤診為結(jié)核病而接受不恰當(dāng)?shù)闹委煟瑥亩鴮?dǎo)致NTM病患者病情惡化，進(jìn)而加重個(gè)人及國家的負(fù)擔(dān)。因此，在診療活動中，及時(shí)有效的確定致病菌是否為NTM十分必要。由于PNB-TCH 生長試驗(yàn)具有操作簡單、費(fèi)用低等優(yōu)勢，國內(nèi)絕大部分實(shí)驗(yàn)室使用這種方法來初步區(qū)分MTBC和NTM。

本研究結(jié)果顯示，PNB-TCH生長試驗(yàn)和PCR-探針法檢出的NTM符合率為75.4%，MTBC的符合率為99.0%，總體符合率為99.0%；13株經(jīng)PNB-TCH鑒定為MTBC的菌株，最終經(jīng)測序鑒定的結(jié)果全部是NTM，說明部分NTM使用PNB-TCH生長試驗(yàn)進(jìn)行鑒定時(shí)會出現(xiàn)誤判[5]，而PCR-探針法鑒定MTBC和NTM的準(zhǔn)確性較高。

PNB-TCH生長試驗(yàn)主要是利用PNB在500 μg/ml的濃度下選擇性抑制MTBC生長，而不抑制大多數(shù)NTM的生長的原理。有文獻(xiàn)報(bào)道，12%的NTM菌株受到PNB抑制，即對PNB敏感[5]。本研究涉及的樣本中，結(jié)果顯示有21.7%的NTM菌株對PNB敏感。同時(shí)，本研究顯示只有0.1%的MTBC對PNB產(chǎn)生耐受性，明顯低于文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果[6]。本試驗(yàn)中對PNB敏感的NTM樣本中,需要光學(xué)照射才能產(chǎn)生色素的堪薩斯分枝桿菌占大多數(shù)(76.9%)。該結(jié)果提示，在NTM中，特別是堪薩斯分枝桿菌對PNB敏感的現(xiàn)象應(yīng)該引起重視。此前有文獻(xiàn)報(bào)道，堪薩斯分枝桿菌對PNB的敏感度達(dá)到了60.9%[6]。所以在采用PNB培養(yǎng)基進(jìn)行分枝桿菌菌群初步分類時(shí)，如出現(xiàn)菌株對PNB敏感，但菌落呈橘黃色、且對一線，二線抗結(jié)核藥物耐藥等符合NTM的特征時(shí)，應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)的生物表型試驗(yàn)，或使用PCR-探針法進(jìn)行鑒定，以免將此類NTM誤判為MTBC導(dǎo)致誤診。

本試驗(yàn)中的一個(gè)樣本為結(jié)核分枝桿菌和戈登分枝桿菌的混合菌，提示極少數(shù)待檢樣本可能含有兩種、甚至多種分枝桿菌。造成該結(jié)果的原因很多，其中盡管不能排除發(fā)生實(shí)驗(yàn)室交叉污染的可能，但同時(shí)提示臨床上分枝桿菌混合感染而導(dǎo)致疾患的情況也應(yīng)引起注意。

目前我國分枝桿菌菌種生物表型鑒定實(shí)驗(yàn)，主要在專業(yè)技能較高的結(jié)核病專業(yè)實(shí)驗(yàn)室開展，且大部分是在藥敏試驗(yàn)的同時(shí)進(jìn)行PNB-TCH 生長試驗(yàn)，結(jié)果報(bào)告需要1 個(gè)月的時(shí)間，無論從方法的特異性、還是檢測結(jié)果的時(shí)效性，均不能滿足臨床診療活動的需求。作為分子水平檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，核酸測序技術(shù)發(fā)展很快，但是，16S rRNA測序操作要求相對較高，而且需要特殊專業(yè)儀器的支持，絕大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)室均無法作為常規(guī)手段用于臨床。同時(shí)，由于樣本需送測序公司檢測，導(dǎo)致檢測報(bào)告周期也存在極大的不確定性,并且，基因測序的成本也制約了相應(yīng)方法的大范圍應(yīng)用。近年來，熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍，具有特異性強(qiáng)、敏感度高、定量準(zhǔn)確、簡單易行等優(yōu)點(diǎn)，被越來越多的應(yīng)用于分枝桿菌的檢測[7],本研究采用的PCR-熒光探針法，其鑒定結(jié)果與測序相比，符合率達(dá)100%；同時(shí)，從提取核酸擴(kuò)增開始到出具檢測結(jié)果僅僅需要 2 h，其快速的檢測報(bào)告周期和準(zhǔn)確的檢測結(jié)果可以滿足臨床確診的需求。本研究結(jié)果及相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，均證實(shí)PCR-探針法有較高的特異度和敏感度，特別是可以直接利用抗酸染色陽性的痰標(biāo)本進(jìn)行檢測[8]，這些特點(diǎn)使其應(yīng)用性較強(qiáng)，為該方法的普及提供了有力的依據(jù)。

[1] 全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室．2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告．中國防癆雜志，2012，34(8)：485-508．

[2] 中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會．結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程．北京：中國教育文化出版社，2006：54，56-57．

[3] 王忠仁，張宗德，張本．非結(jié)核分枝桿菌病的流行趨勢．中華結(jié)核和呼吸雜志，2000,23：263-265．

[4] 王巍.重視非結(jié)核分枝桿菌病診斷和治療的研究. 傳染病信息, 2009, l:14-17.

[5] 李國利，張靈霞，陳澎．對硝基苯甲酸生長試驗(yàn)鑒別結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌應(yīng)用評價(jià). 臨床肺科雜志，2009，14(12): 1648-1649．

[6] 吳龍章,譚守勇,等.對硝基苯甲酸與鹽酸羥胺對分枝桿菌菌群進(jìn)行初篩的比較.中華結(jié)核和呼吸雜志，2013,36(11):833-835.

[7] ParasharD，ChauhanDS，SharmaVD，etal．Applications of real-time PCR technology to mycobactcrial research．Indian J Med Res，2006，124(4)：385-398．

[8] 梁建琴，高華方，李洪敏，等．PCR-熒光探針法快速檢測結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌．中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會2011年學(xué)術(shù)會議論文匯編，2011，20(1)：20-23．

(本文編輯：范永德)

Comparative study between the traditional culture method and PCR-fluorescent probe method in the identification of mycobacterium species

ZHANGJie*,XINGQing,WANGSu-min,YIJun-li,YANGXin-yu,DINGBei-chuan,SUJian-rong.

*LaboratoryofBeijingFriendshipHospitalaffiliatedtoCapitalMedicalUniversity(on-the-jobpostgraduatestudentofBenjingResearchInstituteforTuberculosisControl),Beijing100050,ChinaCorrespondingauthor:SUJian-rong,Email:youyilab@163.com

Objective To compare the traditional culture method with PCR-fluorescence probe method for the identification of mycobacteria. Methods One thousand five hundred and fifty two mycobacterial strains from clinical isolates were tested by PNB-TCH growth test and PCR-fluorescent probe method, in which the strains with different testing results were confirmed by 16S rRNA gene sequencing method. Results Between two methods, the coincidence rate of non-tuberculosis mycobacteria (NTM) was 75.4% (46/61), the coincidence rate ofMycobacteriumtuberculosiscomplex (MTBC) was 99.0% (1491/1506), and the overall coincidence rate was 99.0% (1537/1552). 15 strains with different testing results were sequenced with 16S rRNA gene, in which 14 were consistent with the results of PCR-probe method, and 1 was isolated and cultured, then confirmed with mixed bacteria ofMycobacteriumtuberculosisandMycobacteriumGordon. The sensitivity of PNB culture for NTM was 21.7% (13/60), and the PNB-resistant rate of MTBC was 0.1%(1/1492). Of 13 PNB-sensitive NTM stains, 10 (76.9%) wereMycobacteriumkansasii. Conclusion The identification of part NTM isolates was misjudged using the PNB-TCH growth tests, while the PCR-fluorescent probe method for the identification of MTBC and NTM strains had higher accuracy.

Nontuberculous mycobacteria；Mycobacteriumtuberculosis； Bacteriological techniques； Polymerase chain reaction； Comp study

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.03.014

100050 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)科[張潔(北京結(jié)核病控制研究所在職研究生)、蘇建榮]；北京結(jié)核病控制研究所中心實(shí)驗(yàn)室(邢青、王甦民、易俊莉、楊新宇、丁北川)

蘇建榮，Email:youyilab@163.com

2014-08-29)