鄭紅霞章偉明周紅娟張 雯于健寧汪 衛(wèi)

薏苡仁酯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠Th17細(xì)胞分化作用研究

鄭紅霞1章偉明2周紅娟1張 雯1于健寧1汪 衛(wèi)1

目的 研究薏苡仁酯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子白細(xì)胞介素－17（IL－17A）的作用。方法 健康SPF級DBA/1 7～8周雄性小鼠20只，測定造模對照組（經(jīng)生理鹽水治療后CIA小鼠）、薏苡仁酯組（經(jīng)薏苡仁酯注射液治療后CIA小鼠）小鼠脾臟Th17細(xì)胞及血清中IL－17變化。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析小鼠脾臟中Th17細(xì)胞的比例，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測小鼠血清中IL－17A含量。結(jié)果 經(jīng)薏苡仁酯注射液治療后，薏苡仁酯組CIA小鼠脾臟中Th17細(xì)胞比例較造模對照組顯著降低（1.82%比4.99%，P＜0.05），小鼠血清中IL－17A的含量也明顯低于造模對照組［（3.54±0.61）pg/mL比（8.31±0.25）pg/mL，P＜0.05］。結(jié)論 薏苡仁酯對CIA小鼠Th17細(xì)胞具有分化作用。

小鼠；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；薏苡仁酯；Th17細(xì)胞；白細(xì)胞介素－17

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為特征的慢性自身免疫性疾病。炎癥反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙，甚至致殘。Th17細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的一種不同于Th1、Th2細(xì)胞的新型CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞亞群，主要分泌IL－17，IL－6、TNF等細(xì)胞因子，Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子與RA疾病的嚴(yán)重程度成一致性[1－2]。薏苡仁中的薏苡仁酯具有抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)作用[3－5]。本研究觀察薏苡仁酯作用于膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠，對小鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL－17的作用。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物 健康SPF級DBA/1 7～8周雄性小鼠20只，平均體質(zhì)量（18±2）g。購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［許可證號碼：SCXK（滬）2012－0002］。

1.2 藥 品 薏苡仁酯注射液（商品名：康萊特注射液，浙江康萊特藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號1401032－1），生理鹽水（杭州民生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號C1404031）。

1.3 試劑及儀器 卡介苗購自中國藥品生物制品檢定所，牛Ⅱ型膠原（CⅡ）購自Chondrex公司，不完全弗氏佐劑購自美國Sigma公司。PE標(biāo)記抗小鼠CD4抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗小鼠IL－17A抗體及其相匹配的同型對照抗體、莫能霉素（monensin）、小鼠IL－17A的ELISA檢測試劑盒均購自eBioscience公司。離子霉素（ionomycin）、乙酸肉豆蔻佛波醇（phorbolmyristic acetate，PMA）購自Sigma公司。RPMI－1640培養(yǎng)液、小牛血清購自Gibco公司。儀器：流式細(xì)胞儀購自美國BECKMAN COULTER公司，型號EPICS XL。酶標(biāo)儀購自美國，型號PowerWaveXS。

2 方法

2.1 造 模 取等體積CⅡ與弗氏完全佐劑1：1混合，充分研磨至混合物完全乳化，以乳化物滴入水中不松散為度（冰浴中操作），取乳化后的CⅡ于小鼠尾根部皮內(nèi)注射（0.1mL/只），并使乳化物吸收完全。模型小鼠制備初次免疫（第0天），每只小鼠尾根部、背部多點(diǎn)（4～5點(diǎn)）皮內(nèi)注射0.1mL/只乳化后CⅡ。加強(qiáng)免疫（第21天），尾根部、背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射同等劑量的該乳劑作為激發(fā)。

2.2 分組及給藥 將造模成功的20只小鼠隨機(jī)分為模型對照組10只，薏苡仁酯組10只。從造模第22天開始給藥，薏苡仁酯組分別予薏苡仁酯注射液25mL/kg每天腹腔內(nèi)注射1次。模型對照組注射生理鹽水25mL/kg，每天腹腔內(nèi)注射1次。治療3周后處死小鼠。

2.3 小鼠脾臟中CD4+IL－17細(xì)胞比例檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。將分離出脾細(xì)胞用RPMIl640培養(yǎng)液按l：1體積比稀釋后，加入PMA、離子霉素和莫能霉素并充分混勻，于37℃、50mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h，用于Th17細(xì)胞的檢測。FCM測定各組用藥后Th17細(xì)胞：將培養(yǎng)細(xì)胞加入10μL PerCp－抗CD3 mAb和10μL PerCp－抗CD4 mAb，于4℃避光孵育30min后，加NH4C1溶血?jiǎng)?mL，以1500r/min離心5min。棄上清，加入1mL Fixation/Permeabilization穿膜45min。用洗液洗滌后，加入10μL PE抗人IL－17A Mat，于4℃避光孵育30min對胞內(nèi)細(xì)胞因子IL－17A進(jìn)行染色，最后經(jīng)洗液洗滌后，以300μL PBS重懸細(xì)胞。檢測染色固定后的標(biāo)本。以CD4+T細(xì)胞設(shè)門，讀取CD4+IL－17+T細(xì)胞在CD3+CD4+T細(xì)胞中的比率。

2.4 血清IL－17含量測定 ELISA檢測血清IL－17含量，使用IL－17A ELISA kit按照說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀檢測血清樣本的吸光度，計(jì)算樣本濃度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間采用兩樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 用藥后各組小鼠Th17細(xì)胞比例 通過FCM檢測兩組CD4+IL－17+T細(xì)胞比例變化，以CD4+T細(xì)胞設(shè)門，觀察到薏苡仁酯組小鼠脾臟中Th17細(xì)胞比例為1.82%，較造模對照組的4.99%顯著降低，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖l。

3.2 用藥后各組小鼠血清IL－17水平 采用ELISA法檢測兩組小鼠血清中IL－17A含量，薏苡仁酯組IL－17含量為（3.54±0.61）pg/mL，顯著低于模型對照組的（8.31±0.25）pg/mL，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.78，P＜0.05）。

圖1 FCM測定用藥后兩組TH17細(xì)胞比例

4 討論

薏苡仁酯是中藥薏苡仁中提取的有效成分，李大鵬從1975年開始研究從薏苡仁中提取分離抗癌活性成分，發(fā)現(xiàn)薏苡仁中的薏苡仁甘油酯具有抗腫瘤作用，嗣后又研制成功靜脈注射用的“康萊特注射液”（koglaitelnjedion，商品名“康萊特”，又稱KLT），在我國已獲批準(zhǔn)作為抗腫瘤處方藥并得到臨床推廣應(yīng)用[3]。薏苡仁酯除抗腫瘤作用外，早期藥理研究表明薏苡仁有解熱鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)作用[4－5]。

效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞活化后，根據(jù)其產(chǎn)生的細(xì)胞因子和生物學(xué)功能的不同，可分為不同的細(xì)胞亞群，傳統(tǒng)上將其分為Th1、Th2兩個(gè)細(xì)胞亞群。近來研究發(fā)現(xiàn)一類不同于Th1和Th2細(xì)胞的CD4+Th亞群，該亞群細(xì)胞主要產(chǎn)生IL－17，并且不產(chǎn)生Th1和Th2類細(xì)胞因子，被命名為Th17細(xì)胞亞群[1，6－7]。Th17細(xì)胞除分泌IL－17外，也能分泌IL－6、TNF－α等多種細(xì)胞因子，具有較強(qiáng)的促炎癥作用，參與多種自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展[8－9]。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）是當(dāng)前研究RA較理想和最為常用的動(dòng)物模型，它在臨床癥狀和病理表現(xiàn)方面與RA極為相似。國內(nèi)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，用流式細(xì)胞術(shù)及ELISA檢測CIA模型小鼠中Th17細(xì)胞比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CIA模型小鼠的脾臟和引流淋巴結(jié)Th17細(xì)胞均明顯增加，小鼠血清中IL－17水平顯著升高，這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示Th17在CIA發(fā)病過程中具有重要作用[10]?；谶@些機(jī)制的研究，并且考慮到中藥薏苡仁其性涼味甘淡，具健脾滲濕、除痹止瀉、清熱排毒之效，且無毒性的優(yōu)點(diǎn)，我們將薏苡仁酯用于RA的動(dòng)物模型的研究，期望為RA的藥物治療尋找一種有效低毒的藥物。

本研究發(fā)現(xiàn)薏苡仁酯作用于CIA小鼠后可使CIA小鼠脾臟中Th17細(xì)胞及血清中IL－17的含量明顯降低（P＜0.05），結(jié)果提示薏苡仁酯對CIA小鼠Th17細(xì)胞分化可能存在有免疫抑制作用。但薏苡仁酯對CIA小鼠的進(jìn)一步免疫調(diào)節(jié)機(jī)制還需要更加深入的研究。

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（收稿：2014－08－18 修回：2014－09－22）

Effect of Coixenolide on Differentiation of T Helper Cell 17 in Mice with Arthritis Induced by Collagen

ZHANG Hongxia1,ZHANG Weiming2,ZHOU Hongjuan1,ZHANG Wen1,YU Jianning1,WANG Wei1.1 Department of Rheumatology,Zhejiang Province Hospital of the Integration of Traditional Chinese and Western Medicine, Hangzhou(310003),China;2 Chinese Herb Pharmacy,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310003),China

Objective To explore the effect of coixenolide on T helper cell 17（Th17）and its cytokine interleukin－17（IL－17A）in mice with collagen－induced arthritis（CIA）.Methods Twenty DBA/1 mice at age of 7－8 weeks were used to build CIA model,then they were randomly divided into model group and coixenolide－treated group,with 10 mice in each group.Mice in coixenolide－treated group was injected with 25 ml/kg coixenolide and mice in model group were given injection of equivalent normal saline.The proportion of Th17 cells in the spleen of mice and serum IL－17A were determined by flow cytometry and enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）, respectively.Results The proportion of Th17 in the spleen of mice in coixenolide－treated group was significantly lower than that in model group（1.82%vs 4.99%,P＜0.05）.The serum IL－17 A of mice in coixenolide－treated group was significantly lower than that in control group[（3.54±0.61）pg/mL vs（8.31±0.25）pg/mL，P＜0.05].Conclusion Coixenolide has inhibitory effect on differentiation of Thl7 cells in CIA mice.

mice；collagen induced arthritis coixenolide；Th17 cells；interleukin－17

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2011ZB106）

1浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院風(fēng)濕免疫科（杭州 310003）；2杭州市第一人民醫(yī)院中藥房（杭州 310003）

鄭紅霞，Tel：13588458857；E－mail：zhx7854@163.com