胡文靜，張秉堅②?

①浙江大學(xué)化學(xué)系，杭州 310027；②浙江大學(xué)文物與博物館學(xué)系，杭州 310027

古代彩繪文物膠結(jié)材料免疫分析技術(shù)*

胡文靜①，張秉堅①②?

①浙江大學(xué)化學(xué)系，杭州 310027；②浙江大學(xué)文物與博物館學(xué)系，杭州 310027

膠結(jié)材料是彩繪類文物(如各種壁畫、建筑彩繪、陶質(zhì)彩繪等)顏料層的重要組成部分。古人常用天然生物材料，如蛋清、皮膠、骨膠、桃膠等作為彩繪顏料的調(diào)和劑。檢測文物膠結(jié)材料的成分不僅是研究文物工藝史的需要，對于這些瀕危文物的加固保護(hù)也具有十分重要的意義。但是，由于膠結(jié)材料含量很少，雜質(zhì)多、易老化、流失快，加之分析檢測技術(shù)的局限性，使得彩繪類文物膠結(jié)材料的檢測成為當(dāng)今文物分析領(lǐng)域中比較困難的課題。在現(xiàn)代分子生物學(xué)基礎(chǔ)上建立起來的免疫分析技術(shù)，利用抗體和抗原之間的特異反應(yīng)，可以高度靈敏地鑒定出目標(biāo)生物源分子。目前，國內(nèi)外在采用免疫分析技術(shù)鑒別文物成分方面已經(jīng)取得了許多研究成果，特別是以酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)和免疫熒光顯微鏡技術(shù)(IFM)為代表的免疫分析技術(shù)在鑒別文物生物源膠結(jié)材料方面具有明顯的優(yōu)勢。綜述了國內(nèi)外的相關(guān)研究進(jìn)展以及本實驗室的有關(guān)研究工作，同時提出，現(xiàn)有免疫分析技術(shù)以及在其基礎(chǔ)上發(fā)展起來的高靈敏圖像示蹤的化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)(CLIA)等在文物微量成分檢測和空間分布確定等方面還具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

彩繪文物；膠結(jié)材料；免疫分析；酶聯(lián)免疫技術(shù)；免疫熒光顯微技術(shù)

中華文化歷史悠久，留存下大量精美珍貴的物質(zhì)遺存。這些文物除了文化和藝術(shù)價值，同時也是研究古代文明和探索歷史進(jìn)程的重要物證。彩繪類文物，如各種壁畫、建筑彩繪、陶質(zhì)彩繪等是文化和藝術(shù)價值最高的一類文物。研究表明，古代彩繪一般是以天然無機礦物粉體為顏料，加入膠結(jié)材料，經(jīng)過調(diào)配，再經(jīng)過涂繪而制成[1]。膠結(jié)材料是彩繪類文物的關(guān)鍵成分之一[2]。分析膠結(jié)材料的成分不僅是研究文物工藝史的需要，而且對于瀕危文物病害機理的研究，以及設(shè)計和實施加固保護(hù)措施也都具有十分重要的指導(dǎo)意義。中國古代彩繪常用的膠結(jié)材料主要是一些天然生物材料，如蛋清、皮膠、骨膠、血液、桃膠等。這些天然生物材料往往含量少、雜質(zhì)多、易老化、流失快，加之分析檢測技術(shù)的局限性，使得彩繪類文物膠結(jié)材料的分析成為現(xiàn)代文物分析領(lǐng)域中比較困難的課題。

1 傳統(tǒng)檢測技術(shù)

文物膠結(jié)材料的傳統(tǒng)檢測技術(shù)主要有化學(xué)分析法和儀器分析法等?；瘜W(xué)分析法主要是通過觀察反應(yīng)過程中顏色的變化、溶解度及其熔點等物理化學(xué)性質(zhì)來鑒別文物中有機物的具體成分。本課題組已成功研發(fā)出一套從古代遺存物中檢測微量有機膠凝材料(包括淀粉、蛋白質(zhì)、油脂、血料、糖分等)的化學(xué)分析方法[3-4]。儀器分析法主要是以光譜、色譜和質(zhì)譜技術(shù)以及毛細(xì)管電泳技術(shù)為代表，以獲取文物中有機成分的圖譜信息[5-12]。其中，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、紅外光譜法(FTIR)和串聯(lián)質(zhì)譜法是最常用的檢測技術(shù)。氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[13-15]和高效液相色譜法[16-21]通過分析樣品中氨基酸組分分布的特征，來實現(xiàn)對溶解后蛋白分子結(jié)構(gòu)的檢測分析。該類方法的主要缺點是樣品需要在無機溶液中進(jìn)行分離純化、蛋白質(zhì)水解和衍生色譜分析等復(fù)雜的預(yù)處理過程，使得部分與蛋白質(zhì)生物源相關(guān)的信息減少，也會造成各類有機成分中定位和空間分辨相關(guān)信息的丟失。此外，采用復(fù)雜的操作會大大增加樣品損失和污染的可能性。紅外光譜法是彩繪文物中蛋白類膠結(jié)材料檢測分析的一種常用方法，被廣泛應(yīng)用于文物保護(hù)領(lǐng)域[22-26]。不過，由于彩繪文物本身成分復(fù)雜，具有內(nèi)在非均質(zhì)性的特點，來自不同的化合物的復(fù)雜紅外譜信號會妨礙光譜中蛋白質(zhì)的明確識別。此外，該方法缺乏特異性，無法實現(xiàn)蛋白質(zhì)如動物膠、雞蛋和牛奶之間的區(qū)分。最近，有人提議可以將拉曼光譜與多元統(tǒng)計分析法相結(jié)合作為一種檢測技術(shù)，用于蛋白質(zhì)膠結(jié)材料的識別[27]。

2 免疫分析技術(shù)

相對于傳統(tǒng)檢測技術(shù)，在現(xiàn)代分子生物學(xué)基礎(chǔ)上建立起來的免疫分析技術(shù)，利用抗體和抗原之間的特異反應(yīng)，可以高度靈敏地鑒定出目標(biāo)生物源分子，因此在古代彩繪類文物膠結(jié)材料的分析方面具有特有的優(yōu)勢，可以很容易地區(qū)分不同種類的膠結(jié)材料，并且可以鑒定同一類別膠結(jié)材料的不同生物學(xué)來源。對于老化降解的膠結(jié)材料，這種方法同樣具有優(yōu)勢，因為只要降解產(chǎn)物中還殘存一個表位，就可能將其識別出來。

免疫分析技術(shù)的基本原理是抗體和抗原之間的相互作用，檢測的靈敏度取決于抗體和抗原之間反應(yīng)的特異性和靈敏性。到目前為止，免疫分析技術(shù)已經(jīng)實現(xiàn)以雞蛋、牛奶、動物膠、植物膠、酪蛋白等蛋白類物質(zhì)作為膠結(jié)材料的古代壁畫和彩繪雕塑等文物的鑒別[28-31]。檢測中，被檢測材料視為抗原，通過觀察哪一種抗體會與之反應(yīng)生成抗原抗體復(fù)合物，并借助一些標(biāo)記物，如放射性同位素、熒光素、酶、化學(xué)發(fā)光體等，來判斷抗原抗體復(fù)合物生成的信息，進(jìn)而定性或定量地鑒別出被檢膠結(jié)材料。

目前，按照標(biāo)記技術(shù)的不同，免疫分析技術(shù)主要分為免疫酶技術(shù)、熒光抗體技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)五種。綜合考慮各方面因素和技術(shù)本身的特性，免疫酶技術(shù)、熒光抗體技術(shù)成為常用的兩類技術(shù)，而應(yīng)用最廣泛的是免疫酶技術(shù)中的酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA)。

2.1 免疫分析技術(shù)發(fā)展歷程

早在1942年，Coons[32]就用熒光素成功標(biāo)記了抗體。1962年考陶爾德學(xué)院的Jones[33]首次發(fā)表文章，提出將抗原抗體反應(yīng)的特異性運用于鑒別膠凝材料中的有機物。Jones運用免疫擴(kuò)散技術(shù)，其原理是壁畫顏料的蛋白質(zhì)提取物與抗體在凝膠兩端自由擴(kuò)散，若觀察到一條肉眼可見的沉淀線，則說明發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，即該蛋白質(zhì)提取物中含有抗體對應(yīng)的抗原?；蛟S是因為該技術(shù)靈敏度不高，Jones并沒有從古代壁畫顏料層中檢測出蛋白質(zhì)。

1971年Johnson和Packard[28]首次提出將免疫熒光技術(shù)(IFM法)應(yīng)用于檢測膠凝材料中的蛋白質(zhì)，他們使用一種抗體(即直接免疫熒光法)和簡易的熒光顯微鏡檢測出老化蛋彩畫(temper painting)橫截面中的雞蛋清。1982年Talbot[34]使用單抗體和簡易熒光顯微鏡鑒別出仿制樣品中的卵清蛋白和保護(hù)處理后的工藝品中的酪蛋白。1988年Wolbers[35]首次提出將IFM法的雙抗體技術(shù)(即間接免疫熒光法)應(yīng)用于文物膠結(jié)材料的檢測。1989年Kockaert等[29]比較系統(tǒng)地研究了檢測卵清蛋白膠結(jié)材料的IFM方法，他們檢測了13幅繪畫和5個彩繪雕像顏料層的橫截面。結(jié)果顯示老化對卵清蛋白的檢測影響很?。煌瑫r發(fā)現(xiàn)被檢測物的自發(fā)熒光會干擾檢測，特別當(dāng)熒光與被檢顏料層顏色相似時，很難區(qū)分自發(fā)熒光與染色熒光；另外還發(fā)現(xiàn)IFM方法的重復(fù)性差，一次實驗沒有檢出熒光并不代表顏料層中不含卵清蛋白，可能只是單次實驗沒有檢測到。

到1990年，ELISA開始被科研工作者用于考古。他們用ELISA檢測考古挖掘發(fā)現(xiàn)的骨頭的生物來源、工藝品中的血跡和顏料中的膠結(jié)材料[30,36-37]。另外，ELISA也被用于檢測金屬、巖石和木材上腐敗的微生物[38]。1996年美國蓋茨保護(hù)所的Scott等[30]采用ELISA檢測出美國丘馬什族印第安人的顏料沉積物的膠結(jié)材料為動物血和人血。Schweitzer等[39]在2002年發(fā)表的文章認(rèn)為ELISA可以檢測嚴(yán)重老化的蛋白質(zhì)。他們在10～30萬年前的頭蓋骨化石中發(fā)現(xiàn)了具有免疫活性的多肽。

2001年，Ramírez-Barat等[40]的文章提出了一些重要的配套技術(shù)。他們提出可以先用胰蛋白酶處理老化的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)的抗原決定基裸露并且與抗體反應(yīng)。同時，為了減少非特異性的抗體吸附，可以在一抗孵育之前使用封閉液。封閉液是由在本次實驗中沒有免疫活性的蛋白質(zhì)組成，它可以與蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合位點結(jié)合，這樣就排除了抗體與蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合的可能。另外，他們提出理論上可以使用三抗體法來加強熒光效果。三抗體法分三步進(jìn)行：第一步，一抗與抗原上的抗原決定簇特異性結(jié)合；第二步，多個二抗與一抗特異性結(jié)合；第三步，多個熒光標(biāo)記的三抗與二抗特異性結(jié)合。這樣通過一系列的反應(yīng)，信號被一步步地放大。這是一個重要的技術(shù)突破，由此使IFM法用于古代彩繪膠結(jié)材料的常規(guī)檢測成為可能。

2004年，Heginbotham等[41]提出使用ELISA和IFM兩種方法來檢測顏料膠凝材料中的蛋白質(zhì)，以發(fā)揮兩種檢測技術(shù)各自的優(yōu)點，彌補對方的缺點。他們成功地從17世紀(jì)的雕塑彩繪中檢測到蛋清，并且將其精確定位。

2008年Vagnini等[42]對IFM法在科技考古方面的分析能力進(jìn)行了研究。他們分別采用2套抗體檢測繪畫橫截面中的卵清蛋白和牛血清蛋白，研究了3種不同的顏料和2種不同的基底對免疫熒光法檢測的影響。卵清蛋白和牛血清蛋白分別是蛋清和牛乳存在的標(biāo)志。最后，他們使用激光共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光。在激光共聚焦顯微鏡中，熒光是由一個激光光源激發(fā)的。單光源發(fā)出非常強烈的光免除了過濾入射光的需要，簡單的發(fā)射過濾器使散射現(xiàn)象得到有效的抑制。該顯微鏡還可以通過聚焦深度的不同，采集一個樣品不同深度的圖像。研究者發(fā)現(xiàn)，背景熒光主要存在于樣品橫截面的最外層，因此通過調(diào)節(jié)顯微鏡的聚焦深度，可以在一定程度上排除背景熒光。顯微鏡技術(shù)的進(jìn)步使得免疫熒光法在科技考古方面的應(yīng)用前進(jìn)了一大步。

2.2 酶聯(lián)免疫技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)是采用活性酶為標(biāo)記物，在免疫反應(yīng)完成后使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶的含量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與樣品中被檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度(圖1)。

圖1 ELISA的基本原理

辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatasa，AP)為ELISA中常用的兩種酶。當(dāng)采用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為反應(yīng)底物時，其經(jīng)HRP作用后由無色變?yōu)樗{(lán)色，用硫酸終止后，由藍(lán)色變?yōu)辄S色，最適吸收波長為450 nm；當(dāng)采用對硝基苯磷酸酯(p-NPP)作為底物時，在轉(zhuǎn)化酶AP的作用下，對硝基苯磷酸酯轉(zhuǎn)化為對硝基苯酚，在pH為8.5的堿性條件下為黃色染料。顯色反應(yīng)與固定在微孔板上的抗原數(shù)量和酶的活性時間密切相關(guān)。加入緩沖溶液可以停止反應(yīng)的進(jìn)行，并可以實現(xiàn)不同的ELISA檢測之間的定量比照。

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。該測定方法中3種必要試劑包括固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體，以及酶作用底物。檢測方法主要有雙抗體夾心法、雙位點一步法、間接法測抗體、捕獲法和競爭法等。間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。

2010年Julie Arslanoglu等利用ELISA技術(shù)檢驗?zāi)咎ソ鹚苁ゼs翰像的顏料層和18世紀(jì)的室內(nèi)壁畫，他們使用4種蛋白質(zhì)抗體，即卵清蛋白(蛋清)、酪蛋白(牛乳)、膠原蛋白(動物膠)和多聚糖(植物膠)來檢測，最終發(fā)現(xiàn)膠結(jié)材料為蛋清和動物膠。2011年意大利的Palmieri等[43]研究了13種不同的顏料對ELISA檢測結(jié)果的影響。2013年意大利的Potenza等[44]提出用改進(jìn)的斑點酶聯(lián)免疫法(dot-ELISA)檢測壁畫中的蛋清，他們做了一系列實驗尋找最佳的反應(yīng)時間和溫度，同時確定該方法的檢測下限為1 μg?mL-1(5 ng)，并且該方法可以用于半定量檢測。Cartechini等[45]也采用ELISA間接法對文物試樣進(jìn)行檢測(實驗中所使用的一抗、酶標(biāo)抗體、稀釋溶液和檢測限度見表1)，成功地識別出古埃及遺存(200 B. C.—50 A. D.)中含有雞蛋、植物膠和骨膠的成分，17世紀(jì)意大利圣弗朗西斯教堂穹頂壁畫含有雞蛋的成分，17世紀(jì)西藏布達(dá)拉宮壁畫中含有骨膠的成分，并指出ELISA法對識別壁畫中老化的酪蛋白和雞蛋仍發(fā)揮著其特異性的功能，只是有一些動物膠的抗體隨膠層的老化發(fā)生降解。

表1 ELISA實驗中所使用的一抗、酶標(biāo)抗體、稀釋溶液和檢測限度[45]

本實驗室對ELISA應(yīng)用于文物膠結(jié)材料的檢測已開展了一系列的實驗研究，包括①探索卵清蛋白、骨膠、酪素、牛皮膠、魚膠、植物膠等的ELISA檢測方法；②探討了這些檢測的檢測限和有機成分的干擾問題；③研究了常用典型高分子加固材料對ELISA檢測的影響；④嘗試了自己制備不同動物膠和植物膠抗體的可行性；⑤已成功應(yīng)用于國內(nèi)多處古代壁畫和陶質(zhì)彩繪顏料層膠結(jié)材料的檢測，以及各種灰漿中有機添加劑的檢測。例如，本實驗室采用ELISA方法首次實現(xiàn)了蛋清灰漿樣品中微量蛋清成分的準(zhǔn)確檢測，最低檢出限為0.003%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，解決了化學(xué)分析法檢測時容易受樣品中灰土顏色干擾的問題，在蛋清檢測的特異性方面有較大的突破，為研究蛋清灰漿的成分提供了有效檢測技術(shù)[46](表2)。

在ELISA檢測方面，與中國文物膠結(jié)材料相關(guān)的研究還有：英國倫敦大學(xué)考陶藝學(xué)院用ELISA方法嘗試了敦煌壁畫膠結(jié)材料的鑒定[47]；顏菲等[48]用ELISA鑒定出中國北方公元5世紀(jì)墓葬壁畫中含有狗膠原蛋白；洪川等[49]用ELISA對新疆吐魯番鄯善縣蘇貝希遺址出土的黑色塊狀殘留物分析發(fā)現(xiàn)含有少量牛酪蛋白；鄭秦、周旸等[50-53]利用制備的絲素蛋白抗體成功實現(xiàn)了出土文物遺存物中絲素蛋白的特異性檢測，發(fā)現(xiàn)絲素蛋白在家蠶漫長的進(jìn)化過程中仍然具有高度的保守性。

大量研究表明[17,43-45,54]，文物樣品中復(fù)雜的無機成分，如地仗層和礦物顏料等對ELISA 檢測影響不大，同種膠結(jié)材料在不同成分的地仗或顏料中平均光密度吸收值(OD)無明顯差異。ELISA 檢測的平均OD值會隨樣品顏料層的復(fù)雜度和含量波動，某些老化后的礦物顏料會影響ELISA的檢測，但并不是顏料中離子成分直接影響ELISA的檢測結(jié)果，而是由于影響了抗原與抗體的結(jié)合，從而間接影響OD值[55]。ELISA 檢測的是特定蛋白的活性位點，環(huán)境的溫度、熱、氧氣、濕度、空氣污染和光照是導(dǎo)致蛋白類膠結(jié)材料發(fā)生老化降解的主要因素，使其發(fā)生水解、聚合、交聯(lián)和氧化等反應(yīng)[56-58]，降低蛋白的溶解度，從而使活性位點逐漸喪失[59]。

表2 不同系列不同濃度蛋清灰漿標(biāo)準(zhǔn)樣品的ELISA檢測結(jié)果[46]

總體說，ELISA法具有這些優(yōu)點：①只需要微量的樣本；②檢測效率高，經(jīng)濟(jì)實用；③對生物源的識別具有靈敏性和特異性；④可以使用不同抗體鑒定混合蛋白質(zhì)。目前ELISA法已成為應(yīng)用最廣泛的免疫酶技術(shù)之一。ELISA法在文物膠結(jié)材料檢測應(yīng)用中還有待改進(jìn)的方面：①針對老化文物樣本如何選擇最佳抗體；②擴(kuò)大到各種非蛋白類膠結(jié)材料，或提高對非蛋白類天然生物大分子識別的靈敏性；③預(yù)測或降低檢測限的方法，進(jìn)而最大限度地減少文物樣品的采集量；④減少采樣和實驗中可能的污染事件或其他干擾因素；⑤選擇合適的封閉溶液，降低背景底物產(chǎn)生的非特異性抗體的結(jié)合，以及不同蛋白質(zhì)間由于類似抗原表位所引起的交叉反應(yīng)等。

2.3 免疫熒光顯微鏡技術(shù)

免疫熒光顯微鏡技術(shù)(immunofluorescence microscopy，IFM)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微技術(shù)基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。免疫熒光顯微鏡是一種具有高特異性的檢測工具，能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)的明確識別和定位。目前，免疫熒光顯微檢測已經(jīng)被用于繪畫橫截面中蛋白質(zhì)類膠結(jié)材料的檢測，能夠明顯顯示樣品中目標(biāo)蛋白的分布，具有確定的熒光識別標(biāo)記，還可以測定所涉及的動物種屬(圖2)。

圖2 免疫熒光顯微鏡技術(shù)(IFM)的基本原理

IFM的基本原理是以熒光素作為標(biāo)記物，與已知的抗體或抗原結(jié)合，但不影響其免疫學(xué)特性；然后將熒光素標(biāo)記的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原；在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物以及存在的部位。熒光物質(zhì)(熒光素)是一類能吸收激發(fā)光的光能而發(fā)射熒光的物質(zhì)。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)、四乙基羅丹明(RB200)、藻紅蛋白(PE)等。

IFM的主要檢測方法有直接法和間接法兩種：直接法是將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上；間接法主要用于檢測未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異性抗體(一抗)與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，沖洗未反應(yīng)的抗體后，再用標(biāo)記的抗體(二抗)與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原-抗體-抗體復(fù)合物，從而實現(xiàn)未知抗原的檢測。

本實驗室胡文靜等[60]采用間接免疫熒光法對秦俑彩繪樣品橫截面中蛋白質(zhì)的識別進(jìn)行了系列研究，使用卵清蛋白和Ⅰ型膠原蛋白作為標(biāo)記物分別對實驗室模擬彩繪樣品和秦俑彩繪樣品進(jìn)行檢測，以對照和識別樣品中的蛋清和動物膠。檢測流程和部分檢測結(jié)果見圖3。結(jié)果表明：秦俑彩繪樣品中含有蛋清成分，排除了樣品中含有來源于山羊、綿羊、牛、狗、豬和人的I型膠原蛋白的可能性。此外，本實驗室還采用IFM對國內(nèi)多處珍貴彩繪文物中的膠結(jié)材料進(jìn)行了檢測分析，均得到較為滿意的結(jié)果。

圖3 秦俑彩繪膠結(jié)材料的IFM檢測的主要流程(a)和結(jié)果(b)

在IFM檢測方面，與中國文物膠結(jié)材料相關(guān)的研究還有Cartechini等[45]使用Q Dot作為特異性標(biāo)記進(jìn)行間接免疫熒光檢測，通過共焦顯微鏡獲得免疫熒光圖像，識別雞蛋清成分，對西藏布達(dá)拉宮壁畫的檢測得到了滿意的結(jié)果。

IFM法的優(yōu)點：①能夠顯示樣品中目標(biāo)蛋白的分布，尤其當(dāng)樣品具有多層結(jié)構(gòu)時，能夠識別目標(biāo)蛋白的層位關(guān)系；②既能確定蛋白質(zhì)的種類，同時還能避免染色后蛋白質(zhì)顏色與顏料顏色的相互干擾，以及樣品中無機材料對染料的無選擇性吸收帶來的問題。

IFM法在文物膠結(jié)材料檢測應(yīng)用中還有待改進(jìn)的方面：①抑制樣品非特異性熒光反應(yīng)產(chǎn)生的背景干擾，解決該問題的關(guān)鍵是選擇合適的檢測器；②優(yōu)化熒光檢測儀器結(jié)構(gòu)；③IFM對老化蛋白質(zhì)類膠結(jié)材料識別的靈敏性需要進(jìn)一步進(jìn)行實驗評估。

為了改善非特異性背景的干擾，使用激光共聚焦顯微鏡成為最佳選擇之一[61]。激光共聚焦顯微鏡使用高強度的單色光源，消除了使用輻射濾波器造成的光散射問題。此外，還允許通過收集空間濾波的熒光圖像，實現(xiàn)整個截面不同深度的探測。研究表明，樣品的背景熒光主要源自最外層底物的光散射以及抗體的非特異性吸附，所以選擇正確的圖像采集深度，可以輕松地減少焦平面的背景熒光效果。另一方面，可以優(yōu)化樣品的預(yù)處理過程，避免抗體的非特異性吸附現(xiàn)象。常用的方法是使用緩沖溶液進(jìn)行非特異性結(jié)合位點的快速封閉。常用的封閉緩沖溶液為惰性蛋白(通常為脫脂奶粉或BSA)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，能夠與非特異性位點結(jié)合，排除雜質(zhì)對樣品中蛋白質(zhì)膠結(jié)材料IFM識別的阻礙。

2.4 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)

化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)是將高靈敏度的化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合的檢測技術(shù)，是繼酶聯(lián)免疫分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項最新的免疫分析技術(shù)[62]。

化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成一個激發(fā)態(tài)的中間體，當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時，同時發(fā)射出光子(hM)，利用發(fā)光信號測量光量子產(chǎn)生額。這里免疫反應(yīng)是將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體) 直接標(biāo)記在抗原(化學(xué)發(fā)光免疫分析) 或抗體(免疫化學(xué)發(fā)光分析) 上，或者酶作用于發(fā)光底物上[62]。

近10年來，CLIA檢測技術(shù)發(fā)展迅猛，成為目前推廣應(yīng)用最快的免疫分析方法，據(jù)稱其靈敏度和精確度比酶聯(lián)免法和熒光法高幾個數(shù)量級[62]。Sciutto等[63-64]采用CLIA檢測技術(shù)，通過兩種不同的檢測方式，先后實現(xiàn)了同一繪畫橫截面中膠原蛋白和卵清蛋白、卵清蛋白[63]和牛酪蛋白[64]的同時檢測，指出此方法還可以對動物膠的生物學(xué)來源(如牛、豬、兔、魚)進(jìn)行具體的檢測區(qū)分(部分分析結(jié)果見圖4)，并建議將這種技術(shù)與其他檢測技術(shù)相結(jié)合形成優(yōu)勢互補，為研究古代繪畫技術(shù)和藝術(shù)品鑒定提供一個完整的有機成分檢測體系。

圖4 化學(xué)發(fā)光成像免疫分析結(jié)果[63]：(a)待測樣品截面圖；(b)膠原蛋白化學(xué)發(fā)光信號；(c)卵清蛋白化學(xué)發(fā)光信號；(d)兩者疊加的信號圖

3 結(jié)論

近20年來，以現(xiàn)代分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的免疫分析技術(shù)，憑借其高特異性和高靈敏性得到迅速發(fā)展。實踐表明，將免疫分析技術(shù)應(yīng)用于文物膠結(jié)材料的鑒定和有機成分的分析可以有效避免傳統(tǒng)檢測方法的各種不確定性。從目前情況看，免疫分析技術(shù)是分析古代彩繪類文物中蛋白質(zhì)類膠結(jié)材料的較為理想的方法之一。其中ELISA檢測快速、經(jīng)濟(jì)、高效，需要的樣品量僅為幾百納克，檢測限很低；IFM可以顯示文物樣品膠結(jié)材料在微觀結(jié)構(gòu)上的分布和層位關(guān)系，分辨尺度達(dá)微米級；ELISA和IFM具有互補性，特別適合于古代彩繪文物天然生物蛋白類膠結(jié)材料的檢測鑒定。目前，ELISA和IFM都還有改進(jìn)發(fā)展的空間，另外以CLIA為代表的新的免疫分析技術(shù)也正在迅速發(fā)展，充分利用分子生物學(xué)和免疫分析最新科學(xué)技術(shù)發(fā)展的成果，更便捷、精確、快速、經(jīng)濟(jì)、微樣品量地完成文物膠結(jié)材料的鑒定和有機成分的分析是完全可以實現(xiàn)的。

(2015年9月1日收稿)

[1]安晶晶, 閆宏濤. 古代彩繪顏料膠結(jié)材料MALDI-TOF-MS分析表征(Ⅰ)[J]. 科學(xué)通報, 2013, 58: 211-217.

[2]王麗琴. 彩繪文物顏料無損分析鑒定和保護(hù)材料研究[D]. 西安: 西北工業(yè)大學(xué), 2006.

[3]閆宏濤, 安晶晶, 周鐵, 等. 彩繪文物顏料膠結(jié)材料分析與表征研究進(jìn)展[J]. 分析科學(xué)學(xué)報, 2012, 28(5): 708-714.

[4]FANG S Q, ZHANG H, ZHANG B J, et al. The identification of organic additives in traditional lime mortar [J]. Journal of Cultural Heritage, 2014, 15: 144-150.

[5]ZADRO?NA I, PO?E?-PAWLAK K, G?UCH I, et al. Old master paintings—A fruitful fi eld of activity for analysts: Targets, methods, outlook [J]. Journal of Separation Science, 2003, 26: 996-1004.

[6]VANDENABEELE P, EDWARDS H G M, MOENS L. A decade of raman spectroscopy in art and archaeology [J]. Chemical Reviews, 2007, 107: 675-686.

[7]JURADO-LOPEZ A, LUQUE DE CASTRO M D. Use of near infrared spectroscopy in a study of binding media used in paintings [J]. Anal Bioanal Chem, 2004, 380: 706-711.

[8]ANDREOTTI A, BONADUCE I, COLOMBINI M P, et al. Combined GC/MS analytical procedure for the characterization of glycerolipid, waxy, resinous, and proteinaceous materials in a unique paint microsample [J]. Analytical Chemistry, 2006, 78: 4490-4500.

[9]KEUNE K, BOON J J. Imaging secondary ion mass spectrometry of a paint cross section taken from an early netherlandish painting by Rogier van der Weyden [J]. Analytical Chemistry, 2004, 76: 1374-1385.

[10]COLOMBINI M P, ANDREOTTI A, BONADUCE I, et al. Analytical strategies for characterizing organic paint media using gas chromatography/mass spectrometry [J]. Accounts of Chemical Research, 2010, 43: 715-727.

[11]KUCKOVA S, SANDU I C A, CRHOVA M, et al. Protein identif i cation and localization using mass spectrometry and staining tests in crosssections of polychrome samples [J]. Journal of Cultural Heritage, 2013, 14: 31-37.

[12]KAML I, VCELAKOVA K, KENNDLER E. Characterisation and identif i cation of proteinaceous binding media (animal glues) from their amino acid profile by capillary zone electrophoresis [J]. J Sep Sci, 2004, 27: 161-166.

[13]BONADUCE I, BLAENSDORF C, DIETEMANN P, et al. The binding media of the polychromy of Qin Shihuang’s Terracotta Army [J]. Journal of Cultural Heritage, 2008, 9:103-108.

[14]CASOLI A, MUSINI P C, PALLA G. Gas chromatographic-mass spectrometric to the problem of characterizing binding media in paintings [J]. Journal of Chromatography A, 1996, 731: 237-246.

[15]WEI S Y, MA Q L, SCHREINER M. Scientific investigation of the paint and adhesive materials used in the Western Han dynasty polychromy terracotta army, Qingzhou, China [J]. Journal of Archaeological Science, 2012, 39: 1628-1633.

[16]COLOMBINI M P, MODUGNO F. Characterisation of proteinaceous binders in artistic paintings by chromatographic techniques [J]. J Sep Sci, 2004, 27: 147-160.

[17]KERKAERT B, MESTDAGH F, DE MEULENAER B. Detection of hen’s egg white lysozyme in food: Comparison between a sensitive HPLC and a commercial ELISA method [J]. Food Chemistry, 2010, 120: 580-584.

[18]李實. 高速液相色譜技術(shù)在壁畫膠結(jié)材料分析中的應(yīng)用[J]. 敦煌研究, 1992(4): 53-60.

[19]李實. 敦煌壁畫中膠結(jié)材料的定量分析[J]. 敦煌研究, 1995(3): 29-46.

[20]王麗琴, 楊璐, 曹雪筠, 等. 文物顏料中膠結(jié)材料的分析研究[C]//中國文物保護(hù)技術(shù)協(xié)會第六次學(xué)術(shù)年會論文集. 北京: 科學(xué)出版社, 2010: 5.

[21]王麗琴, 楊璐, 周文暉, 等. 壁畫、建筑彩繪文物中幾種測定蛋白質(zhì)方法的比較和評價[J]. 文物保護(hù)與考古科學(xué), 2011, 3(2): 59-63.

[22]LOJEWSKI T, BAGNIUK J, KOIODZIEJ A, et al. Reflective and photoacoustic infrared spectroscopic techniques in assessment of binding media in paintings [J]. Applied Physics A, 2011, 105: 753-761.

[23]MAZZEO R, PRATI S, QUARANTA M, et al. Attenuated total ref l ection micro FTIR characterisation of pigment-binder interaction in reconstructed paint fi lms [J]. Anal Bioanal Chem, 2008, 392: 65-76.

[24]ROSI F, FEDERICI A, BRUNETTI B G, et al. Multivariate chemical mapping of pigments and binders in easel painting cross-sections by micro IR ref l ection spectroscopy [J]. Anal Bioanal Chem, 2011, 399: 3133-3145.

[25]SCHULZ H, KROPP B. Micro spectroscopy FTIR reflectance examination of paint binders on ground chalk [J]. Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 1993, 346: 114-122.

[26]SPRING M, RICCI C, PEGGIE D A, et al. ATR-FTIR imaging for the analysis of organic materials in paint cross sections: case studies on paint samples from the National Gallery, London [J]. Anal Bioanal Chem, 2008, 392: 37-45.

[27]NEVIN A, OSTICIOLI I, ANGLOS D, et al. Raman spectra of proteinaceous materials used in paintings: A multivariate analytical approach for classif i cation and identif i cation [J]. Analytical Chemistry, 2007, 79: 6143-6151.

[28]JOHNSON M, PACKARD E. Methods used for the identification of binding media in Italian paintings of the fifteenth and sixteenth centuries [J]. Studies in Conservation, 1971, 16: 145-164.

[29]KOCKAERT L, GAUSSET P, DUBI-RUCQUOY M. Detection of ovalbumin in paint media by immunofluorescence [J]. Studies in Conservation, 1989, 34: 183-188.

[30]SCOTT DA, NEWMAN M, SCHILLING M, et al. Blood as a binding medium in a Chumash Indian pigment cake [J]. Archaeometry, 1996, 38:103-112.

[31]HODGINS G, HEDGES R. A systematic investigation of the immunological detection of collagen based adhesives[C]//6th International Conference on Non-Destructive Testingand Microanalysis for the Diagnostics and Conservation of the Cultural and EnvironmentalHeritage, Rome. 1999: 1795-1810.

[32]COONS A H, CREECH H J, JONES R N, et al. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fl uorescent antibody [J]. J Immunol, 1942, 45: 159-170.

[33]JONES P L. Some observations on methods for identifying proteins in paint media [J]. Studies in Conservation, 1962, 7: 10-16.

[34]TALBOT R R. The fl uorescent antibody technique in the identif i cation of proteinaceous materials [C]//Papers Presented by Conservation Students at the Third Annual Conference of Art Conservation Training Programmes. Kingston: Queen’s University, 1982: 140-149.

[35]WOLBERS R. Aspects of the cleaning of a pair of portraits attributed to William and Richard Jennys [C]//American Institute for Conservation 16th Annual Meeting. New Orleans, Washington, DC, 1988: 245-260.

[36]CATTANEO C, GELSTHORPE K, PHILLIPS P, et al. Identif i cation of ancient blood and tissue—ELISA and DNA analysis [J]. Antiquity, 1991, 65: 878-881.

[37]GAYLARDE C C. Advances in detection of microbiologically induced corrosion [J]. International Biodeterioration, 1990, 26: 11-22.

[38]TAYLER S, MAY E. Detection of specif i c bacteria on stone using an enzyme-linked immunosorbent assay [J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 1994, 34: 155-167.

[39]SCHWEITZER M, HILL C L, ASARA J M, et al. Identification of immunoreactive material in mammoth fossils [J]. J Mol Evol, 2002, 55: 696-705.

[40]RAMíREZ-BARAT B, VI?A SDL. Characterization of proteins in paint media by immunof l uorescence. A note on methodological aspects [J]. Studies in Conservation, 2001, 46: 282-288.

[41]HEGINBOTHAM A, MILLAY V, QUICK M. The use of immunofluorescence microscopy (IFM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) as complementary techniques for protein identif i cation in artists’ materials [J]. Journal of the American Institute for Conservation, 2004, 45: 89-106.

[42]VAGNINI M, PITZURRA L, CARTECHINI L, et al. Identif i cation of proteins in painting cross-sections by immunof l uorescence microscopy [J]. Anal Bioanal Chem, 2008, 392: 57-64.

[43]PALMIERI M, VAGNINI M, PITZURRA L, et al. Development of an analytical protocol for a fast, sensitive and specif i c protein recognition in paintings by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [J]. Anal Bioanal Chem, 2011, 399: 3011-3023.

[44]POTENZA M, SABATINO G, GIAMBI F, et al. Analysis of egg-based model wall paintings by use of an innovative combined dot-ELISA and UPLC-based approach [J]. Anal Bioanal Chem, 2013, 405: 691-701.

[45]CARTECHINI L, VAGNINI M, PALMIERI M, et al. Immunodetection of proteins in ancient paint media [J]. Accounts of Chemical Research, 2010, 43: 867-876.

[46]張秉堅, 胡文靜, 張坤, 等. 古代三合土灰漿中蛋清的酶聯(lián)免疫檢測研究[J]. 建筑材料學(xué)報. 2015, 18: 716-720.

[47]鄭軍. 免疫檢測技術(shù)在文物膠結(jié)材料檢測中的應(yīng)用[N]. 中國文物報, 2009-09-25(07).

[48]顏菲, 葛琴雅, 李強, 等. 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)初探古代墓葬壁畫膠結(jié)材料中的狗膠原蛋白[J]. 文物保護(hù)與考古科學(xué), 2014, 26(1): 71-75.

[49]洪川, 蔣洪恩, 楊益民, 等. 酶聯(lián)免疫吸附測定法在古代牛奶殘留物檢測中的應(yīng)用[J].文物保護(hù)與考古科學(xué), 2011, 23(1): 25-28.

[50]鄭秦, 吳小鋒, 鄭海玲, 等. 利用絲素蛋白抗體鑒定古代絲織品[J].蠶業(yè)科學(xué), 2014, 40(3): 520-526.

[51]ZHENG Q, WU X F, ZHENG H L, et al. Development of an enzymelinked-immunosorbent-assay technique for accurate identification of poorly preserved silks unearthed in ancient tombs [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2015, 407: 3861-3867.

[52]ZHOU Y, WANG B, SUI M H, et al. Detection of proteinaceous binders in ancient Chinese textiles by enzyme-linked immunosorbent assay [J]. Studies in Conservation, 2014. doi: http://dx.doi.org/10.1179 /2047058414Y.0000000150.

[53]LIU M M, ZHENG Y W, WANG B, et al. Indirect enzyme-linked immune method for the detection of binders in ancient Chinese textiles [J]. Advanced Materials Research, 2014, 886: 80-83.

[54]PALMIERI M, VAGNINI M, PITZURRA L, et al. Identification of animal glue and hen-egg yolk in paintings by use of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [J]. Anal Bioanal Chem, 2013, 405: 6365-6371.

[55]LEE H Y, ATLASEVICH N, GRANZOTTO C, et al. Development and application of an ELISA method for the analysis of protein-based binding media of artworks [J]. Analytical Methods, 2015, 7: 187-196.

[56]DUCE C, BRAMANTI E, GHEZZI L, et al. Interactions between inorganic pigments and proteinaceous binders in reference paint reconstructions [J]. Dalton Transactions, 2013, 42: 5975-5984.

[57]MANZANO E, ROMERO-PASTOR J, NAVAS N, et al. A study of the interaction between rabbit glue binder and blue copper pigment under UV radiation: A spectroscopic and PCA approach [J]. Vibrational Spectroscopy, 2010, 53: 260-268.

[58]DUCE C, GHEZZI L, ONOR M, et al. Physico-chemical characterization of protein-pigment interactions in tempera paint reconstructions: casein/cinnabar and albumin/cinnabar [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 402: 2183-2193.

[59]ZEVGITI S, SAKARELLOS C, SAKARELLOS-DAITSIOTIS M, et al. Collagen models as a probe in the decay of works of art: synthesis, conformation and immunological studies [J]. Journal of Peptide Science, 2007, 13: 121-127.

[60]HU W, ZHANG K, ZHANG H, et al. Analysis of polychromy binder on Qin Shihuang’s Terracotta Warriors by immunofluorescence microscopy [J]. Journal of Cultural Heritage, 2014, 16(2): 244-248.

[61]Navratil M, Mabbott G A, Arriaga E A. Chemical microscopy applied to biological systems [J]. Analytical Chemistry, 2006, 78: 4005-4020.

[62]王蘭蘭. 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)簡介與應(yīng)用進(jìn)展[C]//全國臨床免疫檢驗研討會暨第六屆全國臨床免疫學(xué)術(shù)會議. 南寧, 2009: 2.

[63]SCIUTTO G, DOLCI LS, GUARDIGLI M, et al. Single and multiplexed immunoassays for the chemiluminescent imaging detection of animal glues in historical paint cross-sections [J]. Anal Bioanal Chem, 2013, 405: 933-940.

[64]SCIUTTO G, DOLCI LS, BURAGINA A, et al. Development of a multiplexed chemiluminescent immunochemical imaging technique for the simultaneous localization of different proteins in painting micro cross-sections [J]. Anal Bioanal Chem, 2011, 399: 2889-2897.

(編輯：段艷芳)

Immunoassays technology of binding media in ancient polychrome cultural relics

HU Wenjing①，ZHANG Bingjian①②
①Department of Chemistry, Zhengjiang University, Hangzhou 310027, China; ②Department of Cultural Heritage and Museology, Zhengjiang University, Hangzhou 310027, China

The binding media is the important part of pigment layer in paintings (e.g. ancient murals, painting pottery and ancient building painting, etc.). Egg white, skin glue, bone glue and peach gum, etc. Natural biomaterials are commonly used by the ancients as binding media or adhesives in painting pigments. The detection of the binding media is crucial for studies of cultural relics history and the reinforcement and conservation of endangered cultural relics. Nevertheless, the binding media easily loss and aging resulting from the nature of itself, adding to the limitations of analytical techniques, the research work of cultural relics has been greatly affected. Based on the modern molecular biology, immunological technique has got fast development, taking advantage of the highly specif i city of antigens and antibodies, which would allow different biological source of target molecular to be determined sensitively. At present, the researches of identif i cation of components in cultural relics by immunological technique has got many successful cases, especially represented by ELISA and IFM, had significant advantages in the identification of biological source of binding media. The related research progress and our laboratory research work of the immunoassays for identif i cation of binding media in ancient polychrome cultural relics were reviewed in detail; meanwhile also proposed, existing immunological technique and high sensitivity imaging trace chemiluminescence immunoassay have the potential of imaging or spatially resolved in the identif i cation of micro-components.

polychrome cultural relic, binding media, immunoassay, ELISA, IFM

10.3969/j.issn.0253-9608.2015.05.003

*國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(2012CB720902)和國家文物局創(chuàng)新聯(lián)盟課題(文博函[2012]878號)資助

?通信作者，E-mail：zhangbj@zju.edu.cn