摘 要 以一年生艾納香種子苗為實驗材料，用一水合氯化鈣提供鈣元素，在冬季艾納香生長遲緩期進行3次施肥，測定艾納香的株高、地徑、葉長和葉寬等生長指標(biāo)以及生物量。采用紫外可見分光光度法測定艾納香不同部位中總黃酮的相對含量，并計算總黃酮的絕對含量；采用GC測定艾納香葉片中l(wèi)-龍腦的相對含量，并計算l-龍腦的絕對含量。結(jié)果表明：鈣元素極顯著增加了冬季生長遲緩期的艾納香葉、莖和根生物量，其中5 g/L鈣處理組的艾納香葉生物量極顯著高于其他3個處理組，10、15 g/L鈣處理下的葉生物量極顯著高于空白對照組（CK），分別是對照的3.03倍和2.65倍。鈣元素的施加抑制了艾納香不同部位總黃酮相對含量的積累，然而顯著增加了總黃酮絕對含量。5 g/L鈣處理組的l-龍腦相對含量和絕對含量最高，分別為0.22%和0.22 g，與10、15 g/L鈣和CK組相比，分別增加了37.50%、22.22%、37.50%和100%、100%、450%。在冬季艾納香生長遲緩期施加鈣元素可以顯著促進艾納香葉、莖和根生物量的積累，提高總黃酮和l-龍腦的絕對含量。

關(guān)鍵詞 鈣；艾納香；遲緩期；l-龍腦；總黃酮；生物量

中圖分類號 Q949.783.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The one-year-old seedlings of Blumea balsamifera（L.） DC. were applied with CaCl2·H2O which supplied Ca in slow growth period of winter three times. The height，ground diameter，length of leaf，width of leaf and biomasses were measured. Then，the relative contents of total flavones in different parts of B. balsamifera were determined by UV and the absolute contents of total flavones were calculated. The relative contents of l-borneol in leaves of B. balsamifera were determined by GC and the absolute contents of l-borneol were calculated. The Ca element significantly enhanced the biomasses of leaves，stems and roots. The biomass of leaves under 5 g/L Ca treatment group was the highest. The leaves biomasses under 10 and 15 g/L Ca treatment groups were significantly higher than that in the control（CK）group，with 3.03 and 2.65 times. The application of Ca inhibited the accumulation of total flavones relative contents in different parts. However，it could promote the accumulation of total flavones absolute contents. The relative and absolute contents of l-borneol of 0.22% and 0.22 g under 5 g/L Ca treatment group were the highest，which was higher with 37.50%，22.22%，37.50% and 100%，100%，450%，compared with 10，15 g/L Ca and CK treatment groups，respectively. The Ca element could promote significantly the accumulation of biomasses of leaves，stems and roots，as well as the absolute contents of total flavones and l-borneol in B. balsamifera in slow growth period of winter.

Key words Calcium（Ca）；Blumea balsamifera；Slow growth period；l-borneol；Total flavones；Biomass

艾納香為菊科多年生木質(zhì)草本植物艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.的新鮮或干燥地上部分，具有祛風(fēng)除濕、溫中止瀉、活血解毒之功效[1-2]。廣泛分布于中國的海南、貴州、云南等省份[3]。艾納香中主要含有揮發(fā)油類和黃酮類成分，其揮發(fā)油類主要成分為l-龍腦（l-borneol）[4-6]。目前，艾納香主要作為艾片（天然冰片）和艾納香油的原料被廣泛使用[7-9]。由于近年來人們對艾片和艾納香油需求的不斷增加，導(dǎo)致野生艾納香資源已不能滿足生產(chǎn)的需要，因此，人工栽培艾納香成為解決這一問題的必然途徑。多年來的研究發(fā)現(xiàn)，栽培艾納香中有效成分l-龍腦和總黃酮含量及其藥材產(chǎn)量均低于野生艾納香，而施肥是提高中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的有效手段之一[10]。目前，在艾納香道地產(chǎn)區(qū)貴州省羅甸等地很少給栽培艾納香施肥或僅施少量鈣鎂磷肥。有關(guān)艾納香施肥的研究較少，何元農(nóng)等[11]給艾納香施用農(nóng)家肥圈肥、油枯和柴、一元化肥尿素、過磷酸鈣和氯化鉀以及復(fù)合肥，結(jié)果表明施肥組的經(jīng)濟產(chǎn)量和生物產(chǎn)量均高于對照組，且其有效成分含量不減，其中氮肥對生物產(chǎn)量增加作用明顯；得油率和l-龍腦含量與鉀肥用量呈正相關(guān)關(guān)系，二者與磷肥的直接關(guān)系不顯著。何元農(nóng)等[12]研究發(fā)現(xiàn)氮肥可以提高艾納香藥材的產(chǎn)量及其有效成分的含量。王丹等[13]研究發(fā)現(xiàn)，錳元素極顯著地提高冬季生長遲緩期的艾納香生長指標(biāo)和生物量，對l-龍腦和總黃酮相對含量的提高無顯著影響，但是極顯著提高了其絕對含量。因此，在獲得較高產(chǎn)量的同時，如何提高有效成分的含量，是亟待解決的問題。

鈣是植物所必需的中量元素，地上部分的鈣較多，莖葉尤其是老葉中含鈣量較高。鈣元素是細(xì)胞壁的重要成分，可以穩(wěn)定生物膜，調(diào)節(jié)養(yǎng)分離子的生理平衡、酶促作用以及促進細(xì)胞伸長[14-15]。因此，在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，在海南冬季艾納香生長的遲緩期，研究不同濃度的鈣元素對艾納香生長指標(biāo)、生物量及其有效成分相對含量和絕對含量的影響，以期為后續(xù)艾納香專用肥研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及預(yù)處理 選擇一年生艾納香種子苗，被中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所龐玉新副研究員鑒定為艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.。于2014年1月27日每隔10 d給艾納香葉面噴施鈣肥，共施肥3次。于2014年3月7日取樣。以一水合氯化鈣（CaCl2·H2O）提供鈣元素，分別設(shè)置5、10、15 g/L 3個濃度；另設(shè)空白對照組（CK），即不進行任何處理。

1.1.2 試驗儀器 7890A氣相色譜儀（美國安捷倫科技公司），F(xiàn)ID氫火焰離子化檢測器（美國安捷倫科技公司），G4513A 16位自動進樣器（美國安捷倫科技公司），2012-PCS紫外分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司），CPA225D電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司），KQ-500DB型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；左旋龍腦對照品（阿法埃莎化學(xué)有限公司，批號為10147015，純度>98%），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號為100080-200707，純度為92.5%）；水楊酸甲酯（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所），乙酸乙酯、甲醇、氫氧化鈉（西隴化工股份有限公司），亞硝酸鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），一水合氯化鈣、九水合硝酸鋁（廣州化學(xué)試劑廠），均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 生長指標(biāo)的測定 將艾納香的植株按照根、莖、葉分別進行取樣，用直尺和卷尺分別測量株高、葉長和葉寬，使用電子游標(biāo)卡尺測量地徑，用天平分別測量其生物量。

1.2.2 總黃酮相對含量測定 （1）對照品溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：對照品溶液的配制以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備同王丹等[13]的方法。

（2）供試品溶液的制備：分別準(zhǔn)確稱取陰干后的艾納香葉、莖和根（過20目篩）粉末1.000 0 g，放入具塞錐形瓶中，加甲醇溶液50 mL，稱定重量；冷浸30 min后，在超聲頻率為80 Hz的超聲清洗器中超聲提取30 min；放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻后過濾，取濾液作為供試品。

（3）總黃酮相對含量測定：按照（2）項的方法進行樣品溶液制備，接著測定供試品吸光度值，計算得出艾納香不同部位總黃酮相對含量。艾納香不同部位總黃酮相對含量是指艾納香不同部位中每100個單位質(zhì)量所含總黃酮的單位質(zhì)量數(shù)，為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，單位為%。

1.2.3 總黃酮絕對含量計算 總黃酮的絕對含量為單株艾納香總黃酮產(chǎn)量，指單株艾納香不同部位中所含總黃酮的質(zhì)量，單位為g。

總黃酮絕對含量/g=不同部位總黃酮相對含量/100×對應(yīng)部位藥材生物量

1.2.4 l-龍腦相對含量測定 采用GC法測定艾納香葉片中l(wèi)-龍腦相對含量，具體見王丹等[13]的方法。

1.2.5 l-龍腦絕對含量計算 l-龍腦的絕對含量為單株艾納香l-龍腦產(chǎn)量，指單株艾納香不同部位中所含總l-龍腦的質(zhì)量，單位為g。

l-龍腦絕對含量/g=不同部位l-龍腦相對含量/ 100×對應(yīng)部位藥材生物量

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel進行數(shù)據(jù)錄入及圖表的繪制，采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與One-way ANOVA方差分析，并用Duncan檢驗法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣元素對艾納香生長指標(biāo)的影響

方差分析結(jié)果表明，不同濃度的鈣處理組，艾納香株高、地徑、葉長和葉寬在各處理間差異均不顯著（p>0.05）。由表1可見，與CK處理相比，5、10、15 g/L鈣處理組的葉長均高于CK組，分別增加了42.69%、18.50%和20.05%。

2.2 鈣元素對艾納香生物量的影響

方差分析結(jié)果表明，不同濃度的鈣處理組，艾納香葉、莖和根的生物量在各處理間差異極顯著（p<0.01）。由圖1可見，其中5 g/L鈣處理組的艾納香葉生物量極顯著高于其他3個處理組，10、15 g/L鈣處理組的葉生物量極顯著高于CK組，分別是CK處理葉生物量的3.03倍和2.65倍。5、10 g/L鈣處理組的莖生物量分別為76.71、76.15 g，極顯著高于15 g/L鈣處理組（53.79 g）和CK處理組（36.57 g），分別增加了42.61%、109.72%和41.57%、108.23%。5、10、15 g/L鈣處理組的艾納香根生物量極顯著高于CK組。

2.3 鈣元素對艾納香不同部位總黃酮含量的影響

2.3.1 鈣元素對艾納香不同部位總黃酮相對含量的影響 方差分析結(jié)果表明，不同濃度的鈣處理組，艾納香葉、莖和根中總黃酮相對含量在各處理間差異極顯著（p<0.01）。由圖2可見，CK組的艾納香葉總黃酮相對含量最高，為2.23%，極顯著高于其他3個處理組，與5、10、15 g/L鈣處理組相比，分別增加了57.04%，84.30%和67.67%。CK組的艾納香莖總黃酮相對含量顯著高于5、10、15 g/L鈣處理組。5、10 g/L鈣和CK處理組根總黃酮含量高于15 g/L鈣處理組。

2.3.2 鈣元素對艾納香不同部位總黃酮絕對含量的影響 方差分析結(jié)果表明，不同濃度的鈣處理組，艾納香葉和根中總黃酮絕對含量在各處理間差異極顯著（p<0.01），莖總黃酮絕對含量在各處理間差異顯著（p<0.05）。由圖3可見，5 g/L鈣處理組艾納香葉總黃酮絕對含量為1.37 g，顯著高于其他3個處理，與10、15 g/L鈣和CK組相比，分別增加了65.06%、73.42%和174.00%，差異極顯著。5 g/L鈣處理下莖總黃酮絕對含量顯著高于10、15 g/L鈣處理組。5和10 g/L鈣處理組根總黃酮絕對含量顯著高于15 g/L鈣處理和CK組。

2.4 鈣元素對艾納香葉片中l(wèi)-龍腦相對和絕對含量的影響

方差分析結(jié)果表明，不同濃度的鈣處理組，艾納香葉中l(wèi)-龍腦相對含量在各處理間差異不顯著，l-龍腦絕對含量在各處理間差異極顯著（p<0.01）。由表2可見，5 g/L 鈣處理組的l-龍腦相對含量和絕對含量最高，分別為0.22%和0.22 g，與10、15 g/L鈣處理組和CK組相比，分別增加了37.50%、22.22%、37.50%和100%、100%、450%。

3 討論與結(jié)論

鈣是植物生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)元素之一，是植物細(xì)胞壁的重要成分，可促進細(xì)胞伸長，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)養(yǎng)分離子的平衡，并且還可以消除某些離子的毒害作用[16]。鈣可以顯著增加胡椒、油菜、苜蓿、大豆、烤煙等作物的產(chǎn)量[17-20]。何元農(nóng)等[21]研究證實1～2月是艾納香生長遲緩期，3月為恢復(fù)生長期。本研究于海南冬季艾納香生長的遲緩期研究鈣元素的肥效，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，未施加鈣元素處理（CK）的艾納香幼苗生長遲緩，大部分的植株停止生長，有些植株的葉片已脫落。施加鈣元素的艾納香植株生長較好，葉寬和葉長增加比較明顯，其中5 g/L鈣處理組的葉寬和葉長顯著高于CK處理。鈣元素顯著提高了艾納香根、莖和葉的生物量，這主要與鈣元素的生理作用息息相關(guān)，即可以促進植物細(xì)胞伸長，促進艾納香的生長和生物量的積累，其中5、10 g/L鈣肥效較明顯。因此，在海南冬季艾納香生長的遲緩期需要施加適量的鈣肥，有利于促進艾納香植株生長和生物量的積累，顯著提高藥材產(chǎn)量。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)施加鈣元素對艾納香不同部位的總黃酮相對含量的積累有一定的抑制作用，降低了葉片和莖中總黃酮的相對含量?？傸S酮是艾納香中黃酮類物質(zhì)的總和，是次生代謝產(chǎn)物，而植物次生代謝過程是一個持續(xù)而動態(tài)的過程，并且在這一過程中對營養(yǎng)元素的需求也各有差別。10～11月是海南產(chǎn)艾納香總黃酮相對含量積累的高峰期，而1～2月總黃酮積累比較緩慢，相對含量較低。因此，本研究結(jié)果可能是由于冬季艾納香處于生長遲緩期，鈣元素對次生代謝產(chǎn)物的積累影響不明顯，總黃酮相對含量的積累受到一定的抑制作用，對艾納香初生代謝影響較大，進而導(dǎo)致總黃酮絕對含量（即單株艾納香葉片中總黃酮的積累量）顯著增加。鈣結(jié)合在鈣調(diào)蛋白上，可以活化植物體內(nèi)多種關(guān)鍵酶，進而對細(xì)胞代謝起到調(diào)節(jié)作用[22]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，在海南的冬季，低濃度5 g/L鈣元素顯著提高了艾納香葉片中l(wèi)-龍腦的相對含量，對l-龍腦絕對含量的提高也有顯著的促進作用；鈣元素對艾納香葉片中l(wèi)-龍腦相對含量的影響不顯著，但是卻顯著增加了l-龍腦的絕對含量（即單株艾納香葉片中l(wèi)-龍腦積累量）。綜上所述，在海南冬天艾納香生長的遲緩期，施加鈣元素可以顯著提高艾納香藥材的產(chǎn)量，但對艾納香藥材的質(zhì)量（即有效成分的相對含量）不僅無促進作用，反而抑制其積累，因此在以獲得藥用成分為目的的艾納香栽培中不建議使用。但是，如果從以艾納香作為提取精油的原料方面考慮，施加鈣元素可以顯著提高艾納香藥材的產(chǎn)量和有效成分的絕對含量，即可以提高精油的產(chǎn)量，具有實際的使用價值和意義。本研究為艾納香專用肥的研究提供了理論依據(jù)。本課題后續(xù)將研究艾納香不同生長期的鈣肥肥效，進而確定鈣肥的最適宜施肥時期、施用量及艾納香的最佳采收季節(jié)。

參考文獻(xiàn)

[1] 龐玉新， 謝小麗， 陳振夏， 等. 艾納香本草考[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 42（6）： 10-13.

[2]王 丹， 付萬進， 龐玉新， 等. 艾納香油過敏性和急性毒性實驗研究[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2013， 34（12）： 2 499-2 502.

[3]袁 媛， 龐玉新， 王文全， 等. 中國艾納香屬植物資源與民族藥學(xué)研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 31（4）： 22-27.

[4] Pang Y X， Wang D， Fan Z W， et al. Blumea balsamifera-A Phytochemical and Pharmacological Review[J]. Molecules， 2014， 19： 9 453-9 477.

[5] Saewan N， Koysomboon S， Chantrapromma K. Anti-tyrosinase and anti-cancer activities of flavonoids from Blumea balsamifera DC [J]. J Med Plants Res， 2011， 5（6）： 1 018-1 025.

[6] Nessa F， Ismail Z， Mohamed N. Xanthine oxidase inhibitory activities of extracts and flavonoids of the leaves of Blumea balsamifera[J]. Pharm Biol， 2010， 48（12）： 1 405-1 412.

[7] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）[S]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010.

[8]龐玉新， 王文全， 張影波， 等. 藥用植物艾納香基因組DNA提取方法研究[J]. 廣西植物， 2009， 29（6）： 763-767.

[9] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會. 中華本草[M]. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1999， （7）： 738.

[10] 王 丹， 侯俊玲， 萬春陽， 等. 中藥材施肥研究進展[J]. 土壤通報， 2011， 42（1）： 225-228.

[11]何元農(nóng)， 丁 映， 洗福榮， 等. 肥料種類對艾納香生物產(chǎn)量和有效成分含量的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2005， 33（5）： 53-57.

[12]何元農(nóng)， 丁 映， 冼福榮， 等. 艾納香產(chǎn)量和有效成分含量對氮素營養(yǎng)的反應(yīng)[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 34（2）： 28-30.

[13]王 丹， 龐玉新， 陳振夏， 等. 錳元素對冬季遲緩期的艾納香幼苗生物量和有效成分含量的影響[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 41（21）： 26-30.

[14]陸景陵. 植物營養(yǎng)學(xué)（上冊）[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社， 2003： 61-66.

[15] 申 沛. 鈣對黃姜產(chǎn)量和皂素含量的影響[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2001： 6.

[16] 孫 羲. 植物營養(yǎng)原理[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 1991.

[17]孫光明， 許能餛， 蔡裕行， 等. 胡椒施用白云石灰和微量元素的效果初探[J]. 熱帶亞熱帶土壤科學(xué)， 1996， 5（2）： 116-119

[18] 周 衛(wèi)， 林 葆. 植物鈣素影響機理研究進展[J]. 土壤學(xué)進展， 1995， （2）： 12-17.

[19] 吳明才， 肖昌珍. 大豆鈣素營養(yǎng)[J]. 中國油料作物學(xué)報， 1998， 20（3）： 60-64.

[20]程 森， 吳家森， 王 平， 等. 烤煙煙葉卷曲癥狀的診斷及其機理研究I.癥狀的發(fā)現(xiàn)、初步診斷及機理假設(shè)[J]. 土壤學(xué)報， 2007， 44 （5）： 956-959.

[21]何元農(nóng)， 丁 映， 冼福榮， 等. 艾納香生長發(fā)育特性的初步觀測[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2005， 33（2）： 19-23.

[22]何忠俊， 曾 波， 韋建榮， 等. 鈣對滇重樓生長和總皂甙含量的影響[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2010， 25（5）： 664-669.