周向培

隨著生命科學(xué)的深入發(fā)展，對(duì)腫瘤的致病和發(fā)病機(jī)制的分子生物學(xué)研究為開(kāi)發(fā)低毒高效針對(duì)特異性分子靶標(biāo)的抗腫瘤藥物提供了基礎(chǔ)。組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）是維持染色體的基本組成單位核小體中組蛋白乙?；胶獾年P(guān)鍵酶類之一，其催化組蛋白的去乙?；饔?，與基因轉(zhuǎn)錄抑制密切相關(guān)，牽涉到促基因沉默的諸多過(guò)程，是抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)中的熱門靶標(biāo)。本文就此談?wù)劷M蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）的分類及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

一、組蛋白去乙?；傅姆诸?/p>

基于酵母種系發(fā)育中的不同HDACs的結(jié)構(gòu)同源性分析，真核生物HDACs被分成4類：Ⅰ類HDACs與酵母Rpd3具有同源性，包括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8;Ⅱ類HDACs與酵母Hda1具有同源性，包括HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10，其根據(jù)催化區(qū)域的不同又可分為2類：Ⅱa類具有一段催化區(qū)域，包括HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9，Ⅱb類具有兩段催化區(qū)域，主要包括HDAC6和HDAC10;Ⅲ類HDACs即沉默信息調(diào)節(jié)因子2（silent information regulator2，Sir2）-相關(guān)酶類 （Sir2-related enzymes，sirtuins），其是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴的組蛋白去乙酰化酶類;Ⅳ類HDACs主要是HDAC11，其與Ⅰ、Ⅱ類HDACs差異較大而被獨(dú)立劃歸一類。HDACs家族各成員主要定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，另有少部分定位于胞質(zhì)細(xì)胞器如線粒體中（主要是Ⅲ類HDACs中的SIRT3、SIRT4與SIRT5），HDACs發(fā)揮催化作用的目標(biāo)蛋白種類繁多，常見(jiàn)如抑癌蛋白p53、熱休克蛋白HSP70、Smads蛋白家族等，HDACs正是通過(guò)與催化多種生理過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白而在調(diào)控腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

二、組蛋白去乙?；傅慕Y(jié)構(gòu)特點(diǎn)

1.Ⅰ類HDACs

Ⅰ類HDACs中的HDAC1已被研究證實(shí)，其磷酸化可以促進(jìn)酶本身的催化活性及催化復(fù)合物形成，磷酸化發(fā)生于HDAC1中421位絲氨酸位點(diǎn)Ser421與423位絲氨酸位點(diǎn)Ser423。運(yùn)用K-trap（K-抗酒石酸酸性磷酸酶）親和樹(shù)脂對(duì)HDAC1進(jìn)行純化，SDS-PAGE（聚丙烯酰氨凝膠電泳）分離K-trap純化的HDAC1，考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)蛋白，運(yùn)用質(zhì)譜法鑒定磷酸化基團(tuán)，顯示HDAC1分子量標(biāo)識(shí)物大小分別為75 000、66 000，其他種Ⅰ類HDACs即HDAC2、HDAC3與HDAC8蛋白鑒定分析應(yīng)用Clustal法完成，HDAC1、HDAC2、HDAC8分別由482、488、377種氨基酸構(gòu)成。

2.Ⅱ類HDACs

（1）Ⅱa類HDACs，研究證實(shí)，Ⅱa類HDACs一段保守的鋅結(jié)合域——HDAC4催化序列與Ⅰ類HDACs相區(qū)別的特征是一段鋅離子結(jié)合域，其容納了2種自分子中心分離的蛋白片段。第1個(gè)片段形成了1個(gè)17-氨基酸環(huán)（Lα1-α2），其貢獻(xiàn)了3個(gè)鋅離子配體：His665，Cys667，和His678（圖1A）。第2個(gè)片段是1含35個(gè)殘基的插入體（α6-α7-β3-β4），形成了1個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)，緊接著1個(gè)包含其尖端第4鋅配體Cys751的β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)。值得注意的是，這4個(gè)鋅配體在所有的Ⅱa類HDACs中均高度保守，但在其他種類的HDACs中缺失。此鋅結(jié)合域與環(huán)結(jié)構(gòu)方面不同點(diǎn)的存在導(dǎo)致HDAC4相比HDAC8及HDAH擁有一個(gè)更活躍的活性位點(diǎn)。同時(shí)，在HDAC8、HDLP及HDAH中并不存在催化醋酸鹽反應(yīng)產(chǎn)物釋放的水性通道。

晶胞分析的結(jié)果顯示，在位于鋅結(jié)合域的Cys669與來(lái)自于鄰近分子的Cys700之間，有一分子內(nèi)部的二硫鍵形成。為排除此二硫化物對(duì)抑制物與活性位點(diǎn)間作用可能的影響，對(duì)野生型（WT型）HDAC4與HDAC4催化序列功能性突變體（GOF-HDAC4cd）（包括含有C669A/C700A兩個(gè)突變體與C700A單一突變體）的抑制物結(jié)構(gòu)均進(jìn)行了論證，結(jié)果顯示突變體的結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的無(wú)突變的野生型及排除紊亂狀態(tài)下的鋅結(jié)合域突變體蛋白相同。證明HDAC4cd-抑制劑復(fù)合物的結(jié)構(gòu)域在空間彎曲折疊，且分子內(nèi)部的二硫帶在某些部位已將其封閉。

（2）Ⅱb類HDACs，有研究證實(shí)，Ⅱb類HDACs的HDAC10是一種含有669個(gè)氨基酸殘基的多肽，其由N-末端的Hda1相關(guān)去乙?；蛄信cC-末端的亮氨酸富集序列構(gòu)成組合式的結(jié)構(gòu)。有關(guān)圖中顯示，HDAC10的去乙?；蛄校―AC）用白框表示，亮氨酸富集序列（LRD）用陰影框來(lái)闡明。另HDAC10的去乙?；蛄信cHDAC6對(duì)應(yīng)的區(qū)域的相同及相似度亦在圖中反映，即HDAC10兩段乙?；蛄信cHDAC6的對(duì)應(yīng)序列的相同/相似度分別為54%/62%與53%/60%。詳見(jiàn)1HDAC4結(jié)合態(tài)的催化序列結(jié)構(gòu)模式圖Figure 1Structural diagram of catalytic sequences of HDAC4 in bound state Ⅱb類HDACs的HDAC10序列及與HDAC6比較Figure 2Sequence comparison of HDAC10 and HDAC6。

3.Ⅲ類HDACs

哺乳動(dòng)物有7種Sir2-related enzymes，sirtuins，即Ⅲ類HDACs，包括SIRT1-7。所有成員均含有一段NAD+依賴的催化核序列，其扮演著單-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶（mono-ADP-ribosyl transferase （ART））或者NAD+依賴的去乙酰化酶（DAC）的角色，此催化序列兩端環(huán)繞著可變長(zhǎng)度的N-末端與C-末端序列，在細(xì)胞內(nèi)不同的sirtuins其定位不同。有關(guān)圖中顯示，SIRT1與SIRT5只具有DAC活性，SIRT4與SIRT6只具有ART活性，而SIRT2與SIR3具有DAC與ART兩種活性;在細(xì)胞定位方面，SIRT1主要定位于常染色質(zhì)中，SIRT2重要定位于細(xì)胞質(zhì)中，SIRT3-SIRT5則主要定位于細(xì)胞線粒體中，而SIRT7則定位于細(xì)胞核仁中。詳見(jiàn)Ⅲ類HDACs各成員功能、胞內(nèi)定位及大小比較Figure 3Comparison of function，intracellular localization，and size of Class Ⅲ HDACs。

4.Ⅳ類HDACs，研究人員運(yùn)用cDNA克隆預(yù)測(cè)到人類HDAC11氨基酸序列，揭示了HDAC11擁有347個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框（對(duì)應(yīng)分子量為39 000）。基因數(shù)據(jù)庫(kù)的專家預(yù)測(cè)HDAC11基因定位于人類3p25.2染色體，長(zhǎng)度上跨越25 kb，包含9個(gè)外顯子與8個(gè)內(nèi)含子，在氨基酸水平的序列比較顯示：HDAC11的整個(gè)蛋白組成與已知的HDACs家族成員（HDAC1-HDAC10）僅有微小的同源性（包括酵母菌HOS3蛋白），但HDAC11包含有對(duì)去乙?；δ芫哂袧撛谥匾饔玫乃?部分保守序列，HDAC11與HDACs家族的其他成員共同揭示了一個(gè)假定的催化核序列，此序列可能包括了幾乎所有在真核生物HDACs與原核生物HDAC-相似蛋白中存在的活性不變催化序列。

總之，隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)與計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)等學(xué)科的發(fā)展，以HDACs為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)具有抗腫瘤活性的新型HDACs抑制劑必將具有廣闊的前景。