李曉舟

[摘 要] 目前，分子生物學(xué)分類方法已應(yīng)用于各種生物的鑒定。rDNA作為研究細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的理想材料已被細(xì)菌學(xué)家廣泛采用。其中，16SrDNA，約1.5kb，在生物進(jìn)化過程中較難變異，含有豐富遺傳信息，且其序列變化速度與進(jìn)化距離相適應(yīng)，因此，是相對(duì)較合適的系統(tǒng)發(fā)育指標(biāo)，是現(xiàn)代微生物學(xué)分子鑒定的重要手段之一。本研究將結(jié)合傳統(tǒng)和現(xiàn)代分子生物學(xué)分類方法對(duì)菌株B504進(jìn)行鑒定。

[關(guān)鍵詞] 枯草芽孢桿菌 16S rDNA序列

[中圖分類號(hào)] S1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1003-1650 （2015）11-0064-02

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌B504菌株為本試驗(yàn)室保存；細(xì)菌基因組DNA小提試劑盒為凱基公司產(chǎn)品；PCR反應(yīng)所用試劑為TaKaRa（大連）公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 B504基因組DNA的提取

采用凱基細(xì)菌基因組DNA小提試劑盒提取B504基因組DNA，詳細(xì)過程按說明書[25]進(jìn)行。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)原核生物16S rDNA的保守序列，并參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)通用引物，由TaKaRa（大連）公司合成，引物序列如下：

上游序列：5-AGACGCTGGCGGCGTGC-3

下游序列：5-ATCATCTGTCCCACCTTCGGC-3

1.2.3 PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

1.2.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的檢測

取8μl PCR產(chǎn)物與2μl上樣緩沖液混合，用1.0%瓊脂糖凝膠在100V電壓下電泳，DNAgreen染色。凝膠于UVP紫外成像系統(tǒng)上觀察并拍照【26-28】。

1.2.5 測序

PCR產(chǎn)物送交TaKaRa（大連）公司測序，測序引物同PCR反應(yīng)引物。

1.2.6 16S rDNA序列分析

運(yùn)用BLAST 軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行序列分析，與GenBank中已知的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較對(duì)照，以確定其親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌基因組DNA的提取

采用紫外分光光度計(jì)檢測260/280值為1.834，在1.7～2.0之間，DNA 濃度約為1.3μg·mL-1，電泳檢測基因組DNA無彌散現(xiàn)象（圖3-3），濃度和完整性均符合PCR擴(kuò)增的要求【33】。

2.2 16Sr DNA PCR擴(kuò)增

16Sr DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長約1400bp結(jié)果[34]，見圖3-4。菌株B504的16SrDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3-4所示。電泳結(jié)果表明，以B504菌株提取的總DNA為模板，利用引物，能夠擴(kuò)增出特異性片段，片段大小在1450bp左右。

2.3 16SrDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序

2.4 B504菌株的測序結(jié)果

菌株B504 DNA 經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到PCR產(chǎn)物，經(jīng)測序片段長度為1429bp，已提交GenBank，并獲登錄號(hào)No.FJ437209。

2.4.1 Blast比對(duì)結(jié)果：與GenBank中已知的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)（Blast），搜索到同源性達(dá)到100%的序列有：No.FJ392726（Bacillus subtilis）、No.EU981825（B. amyloliquefaciens）及No.AB244463（B. velezensis）、No.FJ713021（Bacillus licheniformis），結(jié)果見圖3-5。

3 結(jié)論與討論

結(jié)合電鏡觀察和生理生化特征，將B504初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。將測得的B504菌株16S rDNA序列與GenBank中的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)（Blast），結(jié)果發(fā)現(xiàn)與B. amyloliquefaciens（解淀粉芽孢桿菌）、B. velezensis（無中文名稱）、B. licheniformis（地衣芽孢桿菌）同源性達(dá)到100%。

本研究通過細(xì)菌16S rDNA序列測定，并運(yùn)用Blast軟件進(jìn)行比較對(duì)照，發(fā)現(xiàn)菌株B504與B. subtilis、B. amyloliquefaciens、B. velezensis、Bacillus licheniformis的同源性達(dá)100%。解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）與枯草芽孢桿菌（B. subtilis）僅通過形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)性狀難以區(qū)分；但在生理生化反應(yīng)中，解淀粉芽孢桿菌可利用乳糖進(jìn)行發(fā)酵，枯草芽孢桿菌則不可利用乳糖進(jìn)行發(fā)酵。目前，已有多種基因，如gyrA 、cheA 、α-amylase 、yyaR 、yyaO、tetL 、tetB 等應(yīng)用于枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的分類和鑒定。Bacillus licheniformis（地衣芽孢桿菌）可厭氧生長，可利用丙酸鹽，而枯草芽孢桿菌不能厭氧生長，不能利用丙酸鹽，兩者通過生理生化測定易于區(qū)分。

枯草芽孢桿菌分為B. subtilis subsp. subtilis 和B . subtilis subsp. spizizenii 兩個(gè)亞種。大量的試驗(yàn)只是為確定其為枯草芽孢桿菌，對(duì)其屬于亞種分類未作區(qū)分。