李曉舟

[摘 要] 目前，生防細(xì)菌中應(yīng)用較多的主要有：芽孢桿菌、假單胞桿菌、土壤放射桿菌等。其中，芽孢桿菌因其能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機(jī)溶劑的內(nèi)生孢子，是研究較多的一類(lèi)生防細(xì)菌，是理想的生防菌篩選對(duì)象。枯草芽孢桿菌因其抑菌譜廣且對(duì)多種植物病害具較好防效而得到廣泛關(guān)注和研究。本實(shí)驗(yàn)主要是利用傳統(tǒng)方法對(duì)枯草芽孢桿菌B504的細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)及生理生化特性進(jìn)行鑒定。

[關(guān)鍵詞] 枯草芽孢桿菌 革蘭氏染色

[中圖分類(lèi)號(hào)] S436 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1003-1650 （2015）10-0075-02

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌B504由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離保存?？莶菅挎邨U菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillus subtilis 168，對(duì)照菌株大腸桿菌 E. coli Top10由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所保存。

1.2 菌株形態(tài)觀察及生理生化鑒定方法

利用負(fù)染色，通過(guò)透射電鏡觀察菌體的形態(tài)、大小、鞭毛及其著生位置。以常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法分析其形態(tài)和生理生化性狀。

1.2.1 形態(tài)學(xué)特征

①革蘭氏染色：接種針取適量菌苔，涂布于干凈玻片上一滴蒸餾水中，風(fēng)干固定；用結(jié)晶紫混合液（結(jié)晶紫 2 g，草酸銨 0.8 g，95%乙醇20mL，蒸餾水80mL）染色1min，用水沖洗后碘液（碘 1 g，碘化鉀 2 g，蒸餾水300mL）作用1分鐘，經(jīng)過(guò)水洗、吸干； 95%乙醇或丙酮乙醇溶液脫色，流滴至無(wú)色；番紅液染色3分鐘，再次水洗、風(fēng)干，鏡檢。

②鞭毛染色：接種環(huán)取已于斜面上培養(yǎng)18-24h的菌苔適量，置于干凈玻片蒸餾水中，傾斜玻片，使菌液緩慢流淌，均勻分布于玻片上，然后平放于空氣中自然干燥。涂片干燥后，先加甲液染色（丹寧酸 5g， FeCl31.5g ， 1.5%甲醛2mL，1%NaOH1mL， 蒸餾水 l00mL）10min，用蒸餾水沖洗，干燥。再加乙液（2%AgNO3）染色30～60s，加熱，使其稍冒蒸氣而染液不干，冷卻后用蒸餾水沖洗，干燥、鏡檢。

③芽孢染色：孔雀綠染色法，按革蘭氏染色涂片后，加孔雀綠染色液3-4滴，用木莢夾住載玻片，在火焰上加熱，使有蒸汽產(chǎn)生，但勿使沸騰，如此反復(fù)染色10min。在染色中，依據(jù)蒸發(fā)情況隨時(shí)添加染色液或水，使涂面上保持不干。用清水沖洗約半分鐘，至無(wú)多余染色液流下為止。用2%番紅染色3min，水洗，晾干。鏡檢。芽孢呈綠色，菌體和芽孢囊呈微紅色。

④莢膜染色：將結(jié)晶紫自研缽中研磨后，加入95%酒精，繼續(xù)研磨使之溶解，配成A液（結(jié)晶紫2.5g，95%酒精25mL）。將草酸銨溶解在蒸餾水中，配成B液（草酸銨1.0g，蒸餾水100mL） 。將A和B液混合既成。加2-3滴結(jié)晶紫染色液，放置3min，水洗，晾干。鏡檢，菌體周?chē)该鞑糠譃榍v膜。

⑤菌落形態(tài)：用劃線法將菌種接在平板培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)66h，出現(xiàn)單菌落開(kāi)始觀察，觀察內(nèi)容包括形狀和大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落和培養(yǎng)基的顏色等。

1.3 生理生化特征

①芽孢厭氧性測(cè)定：將菌種用接種環(huán)穿刺接種在RA培養(yǎng)基（酪素水解物20g，NaCl5g，巰基醋酸鈉2g，甲基次硫酸鈉1g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL），30℃培養(yǎng)，3d和7d分別觀察，若表面生長(zhǎng)者為好氧菌，沿線生長(zhǎng)或下部生長(zhǎng)者為兼性厭氧菌或厭氧菌。

②耐鹽性和需鹽性：將菌種接種在含3%、5%、7%、10%的肉汁胨液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)，培養(yǎng)3d、7d目測(cè)生長(zhǎng)情況（培養(yǎng)基要十分澄清）。

③1.3.3檸檬酸鹽利用：將菌株接種在檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基（氯化鈉5g，水合硫酸鎂0.2g，磷酸氫銨1g，水合磷酸氫鉀1g，檸檬酸鈉2g，0.04%酚紅10mL，瓊脂12g，蒸餾水1000mL）上，28℃培養(yǎng)3-7d，培養(yǎng)基變?yōu)樘壹t色者為陽(yáng)性，否則為陰性。

④丙酸鹽利用：將菌株接在丙酸鹽培養(yǎng)基（丙酸鈉2g，氯化鈉5g，水合硫酸鎂0.2g，磷酸氫銨 1g，水合磷酸氫鉀1g，0.04%酚紅10mL，瓊脂12g，蒸餾水1000mL）上，28℃培養(yǎng)3～7d，培養(yǎng)基變?yōu)樘壹t色者為陽(yáng)性，否則為陰性。

⑤1.3.5氧化酶：置濾紙一張于干凈培養(yǎng)皿中，滴少許四甲基對(duì)苯二胺的1%水溶液至濾紙濕潤(rùn)。用接種環(huán)取18～24h的菌苔，涂抹在濕潤(rùn)的濾紙上，在10s內(nèi)涂抹的菌苔現(xiàn)藍(lán)色者為陽(yáng)性，60s以上現(xiàn)藍(lán)色者不計(jì)，按陰性處理。

⑥接觸酶：將培養(yǎng)24h的斜面菌種，用接種環(huán)取少許，涂抹于滴有3%過(guò)氧化氫的玻片上，觀察有無(wú)氣泡產(chǎn)生：有，陽(yáng)性；無(wú)，陰性。

⑦甲基紅（M.R）：在試管培養(yǎng)液（蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，pH7.0）中接種菌種，置適溫培養(yǎng)48h。滴入甲基紅試劑（甲基紅0.1g，95%乙醇300mL，蒸餾水200mL）觀察：紅色，陽(yáng)性；黃色，陰性。

⑧ V-P測(cè)定：接種菌種至試管培養(yǎng)液（蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，pH7.0）中，培養(yǎng)24h。 取培養(yǎng)液和40%氫氧化鈉溶液等量混合。加入適量肌酸，靜置10min，觀察：培養(yǎng)液紅色，陽(yáng)性（偶爾出現(xiàn)延長(zhǎng)靜置時(shí)間，培養(yǎng)液才出現(xiàn)紅色）。

⑨淀粉水解：將菌種接種在淀粉瓊脂培養(yǎng)基（在肉汁胨中加0.2%可溶性淀粉）上培養(yǎng)2-5d，形成明顯菌落后，在其上滴加碘液（碘1 g， 碘化鉀2 g， 蒸餾水300mL），觀察菌落周?chē)袩o(wú)透明圈：有，淀粉水解陽(yáng)性；仍呈藍(lán)黑色，陰性。

⑩菌株對(duì)糖類(lèi)物質(zhì)的利用：參照任新正（1994）的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 B504菌株的形態(tài)學(xué)特征

經(jīng)透射電鏡觀察，菌株B504菌體呈桿狀，細(xì)胞大?。?.93～1.4）μm×（3.3～3.9）μm，周生鞭毛（圖3-1-A）。革蘭氏染色呈陽(yáng)性（圖3-1-B、C），芽孢非圓形，不膨大（圖3-1-D），無(wú)伴孢晶體，有莢膜（圖3-1-E）。LB平板培養(yǎng)基上菌落近似圓形，邊緣整齊，呈乳脂色，不透明，前期表面光滑（圖3-1-F），后期表面褶皺明顯（圖3-1-G）。

圖3-1 菌株B504的菌體形態(tài)和菌落形態(tài)

2.2 菌株B504生理生化特征

菌株B504的生理生化特征（表3-1）與標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillus subtilis 168對(duì)比，各項(xiàng)指標(biāo)的陰性、陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果相同，部分生理生化反應(yīng)特征圖（圖3-2）。

表3-1 菌株B504的生理生化特征

注：+ 為陽(yáng)性反應(yīng)；- 為陰性反應(yīng)

圖3-2 菌株B504部分生理生化性狀

A：甲基紅；B：V-P測(cè)定；C：檸檬酸鹽利用；D：淀粉水解

結(jié)論

通過(guò)電鏡觀察，明確觀察到了其菌體形態(tài)、大小和鞭毛著生狀態(tài)及其在LB平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。結(jié)合B504菌株的硝酸鹽還原、葡萄糖產(chǎn)酸等生理生化特征，將B504菌株初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。