丁成國

雷公藤紅素增強(qiáng)多柔比星抑制肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞活性的實(shí)驗(yàn)研究

丁成國

目的 觀察雷公藤紅素增強(qiáng)多柔比星對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性及機(jī)制。方法 設(shè)0.5、1、2μmol/L濃度的雷公藤紅素為雷公藤紅素1、2、3組，設(shè)0.1、1g/mL濃度的多柔比星為多柔比星1、2組；MTT法檢測(cè)多柔比星單獨(dú)治療及聯(lián)合雷公藤紅素治療對(duì)肝癌細(xì)胞系Huh7的殺傷活性。熒光定量PCR方法檢測(cè)人正常胎肝細(xì)胞系L-O2及肝癌細(xì)胞系Huh7、HepG2和PLC的PKM2表達(dá)水平。MTT法檢測(cè)PKM2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對(duì)雷公藤紅素聯(lián)合多柔比星殺傷Huh7細(xì)胞療效的影響。結(jié)果與對(duì)照組Huh7細(xì)胞活力零抑制率比較，雷公藤紅素1、2、3組分別為（2.6±0.9）%、（4.7±1.3）%（P均<0.05）、（8.8±1.9）%（P<0.05）；多柔比星1、2組分別為（7.5±1.9）%、（61.4±4.2）%（P均<0.05）；1μmol/L雷公藤紅素聯(lián)合0.1、1g/mL多柔比星較多柔比星1、2組，Huh7細(xì)胞活力抑制率明顯上升[（58.7±3.8）%比（7.5±1.9）%，P<0.05；（89.7±6.7）%比（61.4±4.2）%，P<0.05]。PKM2相對(duì)表達(dá)水平，相對(duì)人正常肝細(xì)胞系L-O2細(xì)胞系的（1.0±0.05），Huh7細(xì)胞系為（15.2±0.6）（P<0.05），HepG2細(xì)胞系為（11.8±0.5）（P<0.05），PLC細(xì)胞系為（13.4±0.7）（P<0.05）；雷公藤紅素1、2、3組分別下調(diào)為（0.70± 0.05）（P<0.05）、（0.42±0.04）（P<0.05）、（0.31±0.03）（P<0.05）；多柔比星組無下調(diào)作用；1μmol/L雷公藤紅素聯(lián)合0.1、1g/mL多柔比星后PKM2相對(duì)表達(dá)水平較多柔比星1、2組明顯下降 [（0.44±0.04）比（0.98±0.07），P<0.05；（0.41±0.03）比（1.01±0.07），P<0.05]。轉(zhuǎn)染PKM2表達(dá)載體后，1μmol/L雷公藤紅素聯(lián)合0.1、1g/mL多柔比星對(duì)Huh7細(xì)胞活力抑制率較未轉(zhuǎn)染組下降 [（60.5±4.3）%比（19.3± 2.0）%，P<0.05；（91.6±6.9）%比（69.6±4.5）%，P<0.05]。結(jié)論 雷公藤紅素通過下調(diào)PKM2的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的糖代謝，增強(qiáng)多柔比星對(duì)肝癌細(xì)胞系Huh7的殺傷活性。

肝癌細(xì)胞系；Huh7；雷公藤紅素；PKM2；糖代謝；多柔比星

肝癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其致死率居惡性腫瘤第三位[1]。多柔比星是一種抗腫瘤抗生素，通過抑制腫瘤細(xì)胞DNA/RNA的生物合成起到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。多柔比星是治療肝癌的常規(guī)化療藥物，但腫瘤細(xì)胞的藥物抵抗制約了多柔比星的臨床應(yīng)用[2]。因此，尋找其他的藥物與多柔比星進(jìn)行聯(lián)合用藥以增強(qiáng)多柔比星的抗腫瘤活性是目前腫瘤治療研究的重點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，雷公藤紅素有一定的抗腫瘤活性[3-4]。本研究探討雷公藤紅素是否能增強(qiáng)多柔比星對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性，并研究其具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞系Huh7、HepG2、PLC及人正常肝細(xì)胞系L-O2購于上海中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。所有細(xì)胞系培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通入5%CO2。

1.2 材 料 多柔比星、噻唑藍(lán)（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、雷公藤紅素購于美國Sigma-Aldrich。DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pcDNA3.1（plasmid complementory DNA 3.1，真核表達(dá)載體）、Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen。葡萄糖檢測(cè)試劑盒（Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase assay kit）購于美國Molecular Probes公司，乳酸檢測(cè)試劑盒（Lactate assay kit）購于美國BioVision公司。SYBR Green試劑購于日本 TaKaRa。PKM2（pyruvate kinase M2，丙酮酸激酶M2）和GAPDH（內(nèi)參）PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：PKM2上游：5’-GCCTGGCGCCCATTACCA-3’，下游：5’-CCCACTGCAGCACTTGAAG-3’；GAPDH上游：5′-CACTCCTCCACCTTTGA-3′，GAPDH下游：5′-CCACCACCCTGTTGCTG-3′。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 設(shè)0.5、1、2μmol/L濃度的雷公藤紅素為雷公藤1、2、3組，設(shè)0.1、1g/mL濃度的多柔比星為多柔比星1、2組。對(duì)照組不加藥物。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)PKM2的表達(dá) 所有細(xì)胞的總RNA用Trizol試劑提取，之后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書步驟進(jìn)行cDNA的合成。以該cDNA為模板，在PCR體系中加入PKM2或GAPDH的引物，再加入SYBR Green試劑，按照SYBR Green操作說明書步驟進(jìn)行PKM2基因的定量PCR實(shí)驗(yàn)，PKM2的相對(duì)表達(dá)由2-△△CT法計(jì)算[5]。

1.5 Huh7細(xì)胞葡萄糖的攝取及乳酸的檢測(cè) 用葡萄糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)DMEM培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，用C0表示。將Huh7細(xì)胞按1×104/孔接種在96孔板上，加入200μL DMEM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入雷公藤紅素及多柔比星處理2h（對(duì)照組不加藥物處理2h），按照試劑盒說明書步驟檢測(cè)培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，用C表示，則各組葡萄糖絕對(duì)攝取量ΔC= C0-C。葡萄糖的相對(duì)攝取量用以下公式計(jì)算：葡萄糖相對(duì)攝取量=（ΔC對(duì)照組-ΔC治療組）/ΔC對(duì)照組。乳酸的相對(duì)生成量檢測(cè)步驟及計(jì)算方法與葡萄糖相同。

1.6 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 將PKM2基因的開放閱讀框架全序列（Gene ID：NM-001206796）以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成pcDNA3.1-PKM2重組真核表達(dá)質(zhì)粒[6]，質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine 2000按照試劑操作說明書步驟進(jìn)行，將pcDNA3.1-PKM2（2μg/mL）轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中，培養(yǎng)24h。

1.7 MTT法檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性 將Huh7細(xì)胞按 5×103/孔接種在 96孔板上。將pcDNA3.1-PKM2（2μg/mL）轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中，孵育24h。然后再加入雷公藤紅素，及多柔比星培養(yǎng)48h。之后加5mg/mLMTT 20μL繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，在570nmol/L波長下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，細(xì)胞活力抑制率用以下公式計(jì)算：抑制率=（OD對(duì)照組-OD治療組）/OD對(duì)照組×100%。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤紅素提高多柔比星對(duì)Huh7細(xì)胞的殺傷活性 雷公藤紅素單治療對(duì)Huh7的殺傷活性較弱，見表1。1μmol/L雷公藤紅素聯(lián)合多柔比星治療，可顯著提高多柔比星對(duì)Huh7細(xì)胞的殺傷活性，見表2。

2.2 肝癌細(xì)胞系高表達(dá)PKM2 三種肝癌細(xì)胞系Huh7、HepG2和 PLC的 PKM2表達(dá)水平分別為（15.2±0.6）、（11.8±0.5）、（13.4±0.7），均顯著高于正常肝細(xì)胞系L-O2的（1.0±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 雷公藤紅素對(duì)Huh7細(xì)胞的抑制作用（±s）

表1 雷公藤紅素對(duì)Huh7細(xì)胞的抑制作用（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

對(duì)照組雷公藤紅素1組雷公藤紅素2組雷公藤紅素3組3333 0 0.5 12 0 2.6±0.9 4.7±1.3* 8.8±1.9*

2.3 雷公藤紅素顯著下調(diào)Huh7細(xì)胞PKM2的表達(dá)水平并抑制其糖代謝 雷公藤紅素能顯著下調(diào)Huh7細(xì)胞PKM2的表達(dá)水平并抑制其葡萄糖的攝取和乳酸的生成，而多柔比星則對(duì)PKM2表達(dá)水平及糖代謝無影響。見表3。

表2 各組Huh7細(xì)胞抑制作用比較（±s）

表2 各組Huh7細(xì)胞抑制作用比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與多柔比星1組比較；#P<0.05；與多柔比星2組比較，△P<0.05

孔數(shù) 雷公藤紅素濃度（μmol/L） 多柔比星濃度（μg/mL）組別對(duì)照組雷公藤紅素組多柔比星1組多柔比星2組雷公藤紅素+多柔比星1組雷公藤紅素+多柔比星2組333333 010011 00 0.1 1 0.1 1細(xì)胞活力抑制率（%）0 4.7±1.3 7.5±1.9* 61.4±4.2* 58.7±3.8*#89.7±6.7*△

表3 各組Huh7細(xì)胞PKM2表達(dá)及糖代謝比較（±s）

表3 各組Huh7細(xì)胞PKM2表達(dá)及糖代謝比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與多柔比星1組比較，#P<0.05；與多柔比星2組比較，△P<0.05；PKM2：丙酮酸激酶M2

組別對(duì)照組雷公藤紅素1組雷公藤紅素2組雷公藤紅素3組多柔比星1組多柔比星1組雷公藤紅素2組+多柔比星1組雷公藤紅素2組+多柔比星2組孔數(shù)33333333雷公藤紅素濃度（μmol/L）0 0.5多柔比星濃度（μg/mL）120011 0000 0.1 1 0.1 1 PKM2相對(duì)表達(dá)水平1.0±0.03 0.70±0.05* 0.42±0.04* 0.31±0.03* 0.98±0.07 1.01±0.07 0.44±0.04*#0.41±0.03*△葡萄糖相對(duì)攝取量1.0±0.05 0.85±0.05* 0.69±0.04* 0.63±0.04* 1.02±0.06 0.99±0.06 0.71±0.05*#0.68±0.06*△乳酸相對(duì)生成量1.0±0.06 0.86±0.06* 0.61±0.05* 0.52±0.04* 0.98±0.05 1.02±0.07 0.63±0.06*#0.60±0.05*△

表4 雷公藤紅素對(duì)Huh7細(xì)胞PKM2表達(dá)及糖代謝的影響（±s）

表4 雷公藤紅素對(duì)Huh7細(xì)胞PKM2表達(dá)及糖代謝的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與雷公藤紅素+多柔比星1組比較，#P<0.05；與雷公藤紅素+多柔比星2組比較，△P<0.05；pcDNA3.1：真核表達(dá)載體

組別對(duì)照組多柔比星1組多柔比星2組多柔比星1組+pcDNA3.1-PKM2組多柔比星2組+pcDNA3.1-PKM2組雷公藤紅素+多柔比星1組雷公藤紅素+多柔比星2組雷公藤紅素+多柔比星1組+pcDNA3.1-PKM2組雷公藤紅素+多柔比星2組+pcDNA3.1-PKM2組孔數(shù) 雷公藤紅素濃度（μmol/L）pcDNA3.1-PKM2（μg/mL）333333333 000001111多柔比星濃度（μg/mL）0 0.1 1 0.1 1 0.1 1 0.1 1 000220022細(xì)胞活力抑制率（%）0 7.7±0.06* 60.6±3.8* 8.2±0.07* 62.4±4.1* 60.5±4.3* 91.6±6.9* 19.3±2.0*#69.6±4.5*△

2.4 過表達(dá)PKM2顯著抑制雷公藤紅素對(duì)多柔比星抗腫瘤作用的協(xié)同效應(yīng) 體外轉(zhuǎn)染PKM2表達(dá)載體對(duì)多柔比星單治療組的細(xì)胞活力抑制率無影響，但過表達(dá)PKM2能顯著抑制雷公藤紅素對(duì)多柔比星抗腫瘤作用的協(xié)同效應(yīng)，見表4。

3 討論

雷公藤紅素是一種具有多種生物活性的三萜類化合物，來源于中藥雷公藤的根皮，目前臨床上主要用于治療類風(fēng)濕性疾病[7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素還具有一定的抗腫瘤效應(yīng)，如雷公藤紅素在體外能抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖[3]，還能通過激活JNK/ ATF2途徑增強(qiáng)順鉑對(duì)非小細(xì)胞肺癌的抗腫瘤活性[4]。在本研究中，筆者同樣發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素單獨(dú)治療有微弱的抗肝癌細(xì)胞的生物活性，而更為重要的是，雷公藤紅素還能顯著提高化療藥物多柔比星對(duì)肝癌細(xì)胞的治療效果。

腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特征是其與正常細(xì)胞相比，它們的糖代謝異常旺盛。腫瘤細(xì)胞能攝取更多的葡萄糖，但大部分葡萄糖卻不進(jìn)入氧化磷酸化釋放能量，反而進(jìn)行有氧糖酵解合成更多的中間產(chǎn)物，最后生成乳酸，而這些中間產(chǎn)物往往是合成核酸和蛋白質(zhì)的原料[8]。丙酮酸激酶M2（PKM2）是有氧糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，腫瘤細(xì)胞PKM2往往異常高表達(dá)以促進(jìn)有氧糖酵解的進(jìn)行[9-10]。有文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道，腫瘤細(xì)胞的化療藥物耐藥和腫瘤細(xì)胞的糖代謝異常有關(guān)，本研究進(jìn)一步研究雷公藤紅素對(duì)多柔比星的協(xié)同效應(yīng)是否和腫瘤細(xì)胞的糖代謝有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與正常肝細(xì)胞系相比，肝腫瘤細(xì)胞系的PKM2水平顯著高表達(dá)，表明腫瘤的發(fā)生可能和PKM2的異常表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素能顯著降低Huh7細(xì)胞的PKM2表達(dá)水平，并減弱Huh7細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和乳酸的生成，表明雷公藤紅素能顯著抑制肝癌細(xì)胞的糖代謝和有氧糖酵解。為證實(shí)雷公藤紅素增強(qiáng)多柔比星殺傷活性依賴于PKM2的下調(diào)，我們構(gòu)建了PKM2重組表達(dá)質(zhì)粒，使PKM2在Huh7細(xì)胞中過表達(dá)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)Huh7細(xì)胞中PKM2發(fā)生過表達(dá)后，雷公藤紅素對(duì)多柔比星的協(xié)同抗肝癌作用受到顯著抑制，同時(shí)，PKM2的過表達(dá)不影響多柔比星單治療組對(duì)Huh7的殺傷活性。這些結(jié)果證實(shí)雷公藤紅素增強(qiáng)多柔比星抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制是靶向于PKM2基因。

本研究顯示，雷公藤紅素具有化療藥物增效的作用，其分子機(jī)制可能為通過下調(diào)PKM2的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的糖代謝以增強(qiáng)化療藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為雷公藤紅素與化療藥物的聯(lián)合治療方案提供了理論依據(jù)。

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（收稿：2015-06-12 修回：2015-07-10）

Celastrol Enhances the Cytotoxicity of Doxorubicin via Inhibiting the G lucose M etabolism in Hepatocellular Carcinoma Cell Line Huh7

DING Chengguo.Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effect of celastrol on doxorubicin therapy in hepatocellular carcinoma（HCC）in vitro.M ethods HCC cell line Huh7 cells were treated with celastrol alone at 0.5,1,2μmol/L or doxorubicin alone at concentration of 0.1 and 1g/mL or the combination of celastrol（1μmol/L）and doxorubicin（0.1 and 1g/mL）.MTT assay was performed to determine the viability inhibition of doxorubicin plus celastrolon Huh7 cells.RT-qPCR analysis was performed to detect the expression of PKM2 in normal liver cell line L-O2 and HCC cell lines Huh7,HepG2,and PLC.PKM2 expression vector was constructed and then transfected into Huh7 cells treated with celastrol plus doxorubicin.The effect of PKM2 vectors on celastrol plus doxorubicin therapy was detected by MTT assay.Results The Huh7 cell viability inhibition rate was 2.6%±0.9%in 0.5μmol/L celastrol group,4.7%±1.3%in 1μmol/L celastrol group,8.8%±1.9%in 2μmol/L celastrol group;7.5%±1.9%in 0.1μg/mL doxorubicin single group,61.4%±4.2%in 1μg/mL doxorubicin single group,all with a significant difference to that of control group（all P<0.05）.Compared with doxorubicin single group,the cell viability inhibition rate increased to 58.7%±3.8%in 1μmol/L celastrol+0.1μg/mL doxorubicin group and 89.7%±6.7%in 1μmol/L celastrol+1μg/mL doxorubicin group（P<0.05）.The relative expression of PKM2 was as follows:1.0±0.05 on L-O2,15.2±0.6 on Huh7,11.8±0.5 on HepG2,and 13.4±0.7 on PLC（P<0.05）.Celastrol decreased the expression of PKM2 on Huh7（0.70±0.05）,HepG2（0.42±0.04）,and PLC（0.31±0.03）cells（P<0.05）.No effect was observed in doxorubicin single groups,but the expressions of PKM2 in 1μmol/L celastrol+0.1μg/mL doxorubicin group and 1μmol/L celastrol+1μg/ mL doxorubicin group were lower than those of doxorubicin single group（0.44±0.04 vs 0.98±0.07;0.41±0.03 vs 1.01±0.07;all P<0.05）.The synergism of celastrol to doxorubicin was inhibited after the transfection of PKM2,and the cell viability inhibition rate was as follows:60.5%±4.3%in 1μmol/L celastrol+0.1μg/mL doxorubicin group, 91.6%±6.9%in 1μmol/L celastrol+1μg/mL doxorubicin group,19.3%±2.0%in 1μmol/L celastrol+0.1μg/mL doxorubicin+pcDNA3.1-PKM2group,69.6%±4.5%in 1μmol/L celastrol+1μg/mL doxorubicin+pcDNA3.1-PKM2 group（P< 0.05）.Conclusion Celastrol enhances the cytotoxicity of doxorubicin via inhibiting the glucose metabolism in HCC cell line Huh7.This may relate to the downregulation of PKM2 in Huh7 cells.

hepatocellular carcinoma cell line;Huh7;celastrol;PKM2;glucose metabolism;doxorubicin

杭州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（杭州 310006）