王 宇，柳云恩，劉欣偉，張玉彪，周大鵬，劉憲民，項(xiàng)良碧

1.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院骨科，遼寧沈陽(yáng) 110016;2.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng) 110016

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種與年齡相關(guān)的退行性病變，其特征性病變是由軟骨細(xì)胞功能失調(diào)導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨退變。OA的危險(xiǎn)因素包括性別、職業(yè)、吸煙史以及細(xì)胞核遺傳背景，如軟骨基質(zhì)蛋白、聚蛋白多糖酶-2以及緩激肽B2在基因編碼中的突變［1-2］。線粒體在OA的病變中起到一定作用，線粒體 DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)對(duì)OA的影響可能因人種及環(huán)境因素的差異而不同。本文選取沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院的187例膝關(guān)節(jié)OA患者，對(duì)膝關(guān)節(jié)OA與mtDNA的相關(guān)性進(jìn)行研究，評(píng)估m(xù)tDNA單倍群對(duì)OA發(fā)病率的影響及其潛在的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床材料 收集2012年1月至2014年1月就診于我院的187例膝關(guān)節(jié)OA患者作為研究組。其中，女性135例，男性52例，年齡43～86歲，平均年齡(61.59±6.28)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)(ACR)標(biāo)準(zhǔn)［3］診斷為膝關(guān)節(jié) OA，且根據(jù)患者膝關(guān)節(jié)影像學(xué)檢查，按照Kellgren-Lawrence(K-L)評(píng)分［4］OA的病變度為2級(jí)或以上者。將研究組按照K-L評(píng)分分值分為2級(jí)組42例，3級(jí)組66例和4級(jí)組79例。對(duì)照組患者420例，其中女性237例，男性183例，年齡27～84歲，平均年齡(55.32 ±8.98)歲。對(duì)照組為尚未達(dá)到膝關(guān)節(jié)OA診斷標(biāo)準(zhǔn)且無(wú)其他已知的退行性病變(包括癌癥、糖尿病和高血壓可能與線粒體突變有關(guān)的疾病)患者。相關(guān)知情同意書中所有條目均經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 mtDNA測(cè)序和拷貝數(shù)的測(cè)量 采集患者血液樣本并采用十二烷基磺酸鈉(SDS)裂解法從外周血獲取基因組DNA。本研究設(shè)計(jì)2組配套引物以增強(qiáng)mtDNA碎片的作用，這些碎片中包含有亞洲人群mtDNA單倍群中具有診斷意義的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)。這些引物的測(cè)序結(jié)果如下:L15975F:5'-CTCCACCATTAGCACCCAAAGC-3'，H794R:5'-AGGCTAAGCGTTTTGAGCT'G-3'，L9967F:5'-TCTCCATCTATTGATGAGGGTCT-3'，H10858R:5'-AATTAGGCTGTGGGTGGTTG-3'。另一引物的測(cè)序結(jié)果為:299F:GGTGGAAATTTTTTGTTATG，用來(lái)測(cè)量mt16184～mt16193多聚胞苷酸間隔的序列。聚合酶鏈鎖反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀(北京索來(lái)寶生物科技有限公司)。使用步驟:95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火后57℃延伸30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束72℃延伸4 min。mtDNA與核DNA的比值代表mtDNA拷貝數(shù)的相對(duì)量。實(shí)時(shí)PCR采用Real-Time PCR系統(tǒng)(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);試劑盒為SYBR?Green qPCR Mastermix(日本寶生物公司)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。單倍群或SNPs與OA發(fā)病率的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，單倍群、性別和年齡對(duì)OA的影響采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 年齡和性別對(duì)OA發(fā)病率的影響 研究組中女性比例(72.19%)明顯高于對(duì)照組中女性比例(56.43%，OR=0.497，95%CI=0.342 ～0.722，P＜0.01)，同時(shí)均明顯高于各組中男性。進(jìn)行Logistic回歸分析并排除年齡的影響后，其結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=0.537，95%CI=0.362 ～0.796，P＜0.05)。K-L評(píng)分為3級(jí)組的年齡分布(平均61.60歲)和K-L評(píng)分為4級(jí)組的年齡分布(平均63.60歲)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且以上2組患者年齡明顯高于K-L評(píng)分為2級(jí)組中患者年齡(平均56.77歲)，但2級(jí)組和3級(jí)組患者中年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2級(jí)組和4級(jí)組患者中年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。年齡和OA的病變有密切的關(guān)系。

2.2 mtDNA單倍群分析 OA患者中單倍群G出現(xiàn)頻率明顯高于對(duì)照組(OR=3.084，95%CI=1.055～9.017，P＜0.05)。排除年齡和性別的影響，OA和單倍群仍有明顯相關(guān)性(OR=3.834，95%CI=1.139～12.908，P＜0.05)。然而，OA 患者中單倍群R出現(xiàn)頻率明顯低于對(duì)照組出現(xiàn)頻率(OR=0.687，95%CI=0.473 ～0.998，P＜0.05)。單倍群R的效應(yīng)是通過(guò)單倍群F1a和單倍群B產(chǎn)生，而亞群B4則屬于單倍群B4的分支。在排除年齡和性別的影響后，僅單倍群B(OR=0.503，95%CI=0.283～0.893，P＜0.05)和亞群 B4(OR=0.483，95%CI=0.245～0.954，P＜0.05)在 OA患者中出現(xiàn)頻率明顯降低。結(jié)果顯示，單倍群B和B4是OA的保護(hù)因素。未見其他mtDNA單倍群或亞群與OA有相關(guān)性。見表1。

表1 mtDNA單倍群對(duì)膝關(guān)節(jié)OA的影響

2.3 SNPs分析 對(duì)OA患者中個(gè)體的SNPs進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，SNP位點(diǎn)T16140C和T16217C在OA患者中更少表達(dá)，SNP位點(diǎn)T16140C和T16217C決定單倍群B和B4的表達(dá)。在Logistic回歸分析中，排除年齡和性別對(duì)數(shù)據(jù)的影響，SNP位點(diǎn)T16140C(OR=0.370，95%CI=0.142 ～0.958，P＜0.05)和T16217C(OR=0.493，95%CI=0.249 ～ 0.977，P＜0.05)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)其他線粒體單核苷酸多態(tài)性(mtSNPs)進(jìn)行分析，排除年齡和性別的影響，發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)T16362C的存在能夠增強(qiáng)OA的發(fā)病率(OR=1.715，95%CI=1.174～2.506，P＜0.05)。見表2。

表2 線粒體DNA SNPs對(duì)膝關(guān)節(jié)OA的作用

2.4 線粒體DNA單倍群亞群分析 結(jié)果顯示，在病情較重的組別(K-L評(píng)分分值為4級(jí))，單倍群G的出現(xiàn)頻率明顯增高(OR=10.870，95%CI=1.307～90.909，P＜0.05)。對(duì)于單倍群 B(OR=0.812，95%CI=0.304～2.169，P=0.677)和亞群B4(OR=0.880，95%CI=0.277 ～2.801，P=0.829)，2 者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，雖然單倍群D4及其亞群D4a、單倍群N9及其亞群N9a對(duì)OA既非危險(xiǎn)因素也非保護(hù)因素，但攜帶有單倍群D4或D4a的患者OA病情病變更嚴(yán)重，而攜帶有單倍群N9或N9a的患者OA病情病變較輕微。見表3。

表3 mtDNA單倍群對(duì)OA患者K-L評(píng)分4級(jí)組的病變影響

2.5 mtSNPs位點(diǎn)分析 雖然mtDNA SNPs和OA的病情嚴(yán)重性之間的聯(lián)系尚不明確，但mtDNA SNP位點(diǎn)T16362C有加重病情的傾向。見表4。

表4 mtSNPs對(duì)OA患者K-L評(píng)分4級(jí)組的病變影響

3 討論

軟骨細(xì)胞是軟骨中唯一存在的細(xì)胞類型，并且其變性是OA發(fā)生的主要原因之一。最新研究表明，線粒體在OA的病變中起到一定作用［5］。人類線粒體包括超過(guò)1 000種蛋白質(zhì)，其中的13種由mtDNA編碼。mtDNA突變導(dǎo)致的疾病已有諸多報(bào)道［6］。mtDNA突變往往發(fā)生在特定的位點(diǎn)，而非漫長(zhǎng)的人類進(jìn)化中，認(rèn)為其原因是由于線粒體遺傳位點(diǎn)的多樣性［7］。特定的mtDNA單倍群或者單倍型代表著一組SNPs，兩者在遺傳學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有相關(guān)性。許多獨(dú)立的研究表明，mtDNA的遺傳變異性能夠改變線粒體功能，如鈣動(dòng)力學(xué)、呼吸復(fù)合體運(yùn)動(dòng)與mtDNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯［8-9］。尤其許多病例對(duì)照研究表明，mtDNA與許多復(fù)雜疾病，如代謝綜合征［10-11］、神經(jīng)退行性疾?。?2-13］、傳染性疾?。?4-15］、癌癥［16-17］和衰老［18］等相關(guān)。

中國(guó)OA的發(fā)病率與歐洲的發(fā)病率相當(dāng)［19］。在中國(guó)，城市老年人口中患有膝關(guān)節(jié)OA的患者數(shù)約占總?cè)丝诘?3%，高于農(nóng)村地區(qū)的患病率［20–21］。最新研究表明，mtDNA單倍群在西班牙裔人群的髖、膝關(guān)節(jié)OA發(fā)病率中起到一定作用，但與OA相關(guān)的單倍群J僅在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)，而中國(guó)人群中mtDNA 單倍群主要為 A、B、CZ、D、M7、M8 和 F，單倍群F和B在中國(guó)人群中更常見［22］。

作為最常見的關(guān)節(jié)炎，膝OA導(dǎo)致的疼痛及活動(dòng)受限給患者生活帶來(lái)極大不便?；疾〉奈ｋU(xiǎn)因素主要來(lái)自遺傳和環(huán)境［23］。本研究結(jié)果與OA流行病學(xué)研究結(jié)果一致［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，女性比男性更易患OA。此外，隨著年齡增加，OA的病情愈發(fā)加重，進(jìn)一步證實(shí)OA是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病。

病例對(duì)照研究表明，在西班牙裔人群中，單倍群J對(duì)髖關(guān)節(jié)OA和膝關(guān)節(jié)OA均有保護(hù)作用［25］。值得注意的是，單倍體J能夠延緩膝關(guān)節(jié)OA病變的進(jìn)展［26］。然而，mtDNA對(duì)OA的影響可能因人種以及環(huán)境因素的差異而不同。本研究表明，單倍群G和mtSNPs位點(diǎn)T16362C增加OA的風(fēng)險(xiǎn)，而單倍群B和mtSNPs位點(diǎn) T16140C、T16217C能夠降低OA的易感性。

本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶有單倍群G的患者其病情病變更為嚴(yán)重。由于線粒體突變是與年齡相關(guān)的退行性疾病(如OA)發(fā)病的主要原因之一［6］。由此認(rèn)為OA患者上調(diào)了mtDNA的拷貝數(shù)作為線粒體突變的代償性機(jī)制。以往研究表明，單倍群G能夠增加mtDNA缺失的發(fā)生率和線粒體活性氧的產(chǎn)生。因此，認(rèn)為其能夠增加肺癌的風(fēng)險(xiǎn)［27］。而在本研究中，OA患者的外周血(含有單倍群G)中未發(fā)現(xiàn)這種代償機(jī)制，這表明其他含有mtDNA單倍群的細(xì)胞(如軟骨細(xì)胞)由于氧化應(yīng)激的緣故更容易受到損傷。mtDNA SNP位點(diǎn)16140C對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)性作用是通過(guò)上調(diào)mtDNA拷貝數(shù)來(lái)加強(qiáng)線粒體功能，從而免遭氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷以及細(xì)胞凋亡。有相關(guān)報(bào)道認(rèn)為，mtDNA單倍群B和B4在膽道閉鎖及口腔扁平苔蘚的發(fā)生中作為保護(hù)因素［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA單倍群B和B4對(duì)OA的發(fā)生具有保護(hù)性作用。進(jìn)一步的線粒體功能性研究證實(shí)，單倍體B和B4能夠增加線粒體膜電位和mtDNA拷貝數(shù)，因此降低活性氧的水平和應(yīng)激下細(xì)胞凋亡的數(shù)目，保護(hù)軟骨細(xì)胞［29］。所有這些交互作用均支持單倍群B和B4對(duì)軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用的觀點(diǎn)。同時(shí)，以往的研究和本研究均證實(shí)，DNA單倍群B、B4和單倍群J(均為R的分支)對(duì)中國(guó)人群及西班牙人群分別具有保護(hù)作用，但是R的其他分支R9和R11并無(wú)類似作用［30］。由此表明，是單倍群R分支各自不同的mtDNA變異而不是來(lái)自單倍群R分支共有的mtDNA突變決定單倍群B、B4和單倍群J對(duì)OA的保護(hù)性作用。

在本研究中，SNP位點(diǎn)T16362C是唯一與單倍群不相關(guān)卻能夠增加OA風(fēng)險(xiǎn)的mtSNPs。T16362C與G11778A的聯(lián)合作用分別與波蘭的乳腺癌以及日本老年人的萊伯遺傳性視神經(jīng)病發(fā)生相關(guān)［31-32］。雖然目前還沒有進(jìn)一步的功能性研究涉及T16362C，但是以往研究和本研究認(rèn)為，T16362C是人類退行性病變的危險(xiǎn)因素［33］。為了進(jìn)一步明確結(jié)論，需更大樣本量研究來(lái)證實(shí)mtDNA單倍群對(duì)OA的作用。

本研究認(rèn)為，單倍體G和T16362C是OA發(fā)生的危險(xiǎn)因素，而單倍體B及其次級(jí)產(chǎn)物單倍體B4與其診斷性線粒體SNPs位點(diǎn)T16140C、T16217C是OA發(fā)生的保護(hù)因素。本研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA拷貝數(shù)在OA患者中調(diào)高，mtDNA的遺傳背景通過(guò)上調(diào)OA患者中mtDNA拷貝數(shù)進(jìn)而影響OA的發(fā)病率。為了解mtDNA遺傳背景在OA發(fā)生及病變中的作用，仍需進(jìn)一步研究。

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