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自噬抑制劑3-MA對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞Jagged-1蛋白表達(dá)及其增殖的影響

謝杰斌1，龐月珊2，王崇樹1，魏壽江1，王攀1，唐景1

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，川北醫(yī)學(xué)院肝膽胰研究所;2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院疼痛科，四川南充637000)

【摘要】目的:探索自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine 3-MA)對(duì)結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Jagged-1蛋白表達(dá)及其增殖活性的影響。方法:實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和3-MA藥物組(5 mmol/L)，利用CCK-8法檢測細(xì)胞活性;用Annexin/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率;采用免疫組化和Western blot檢測Jagged-1蛋白在兩組中的表達(dá)差異。結(jié)果: Western blot及免疫組化結(jié)果表明: 3-MA作用后，與對(duì)照組比較，結(jié)直腸腺癌細(xì)胞內(nèi)Jagged-1蛋白的表達(dá)顯著被抑制(P＜0.05); 3-MA作用后，結(jié)直腸腺癌細(xì)胞增殖率為(85.23％±5.61％)，與對(duì)照組增值率比較具有顯著差異(P＜0.05); 3-MA作用后，結(jié)直腸腺癌細(xì)胞凋亡率為(11％± 4.3％)，與對(duì)照組凋亡率(4.5％±2.1％)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論: 3-MA可能通過抑制結(jié)直腸腺癌細(xì)胞中Jagged-1蛋白表達(dá)和結(jié)直腸腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤生物學(xué)作用。

【關(guān)鍵詞】Jagged-1;結(jié)直腸腺癌;自噬;3-甲基腺嘌呤

結(jié)直腸癌是臨床中常見消化道惡性腫瘤，手術(shù)及化療是其主要的治療手段，盡管近年在手術(shù)、放療、化療及生物治療等方面取得一定的進(jìn)展，但由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性及其對(duì)化療藥物的耐藥性，使目前療效受到不同程度的限制，大部分患者死于復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅人類的健康。研究發(fā)現(xiàn)自噬和Notch信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都具有重要的作用［1-3］，然而，關(guān)于兩者之間有無相互影響目前尚不十分明確。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的自噬活性，初步探討抑制結(jié)直腸癌自噬活性后對(duì)Notch信號(hào)通路的主要配體—Jagged-1蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究兩者的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑

人大腸癌細(xì)胞株SW480購于中科院上海細(xì)胞庫; CCK-8試劑盒購于中國南京凱基生物科技公司;胎牛血清(優(yōu)級(jí))購于杭州四季青生物工程材料有限公司;3-MA購于美國Gibco公司;兔抗人Jagged-1多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司; WB相關(guān)試劑購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組細(xì)胞在含15％胎牛血清的新鮮1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃，二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5％，飽和濕度，待細(xì)胞達(dá)到80％的生長面積時(shí)，按不同處理因素隨機(jī)分為對(duì)照組與3-MA藥物組。3-MA藥物組加入3-MA (終濃度為5 μmol/L);對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)基。

1.2.2細(xì)胞增殖活性的檢測挑選處于對(duì)數(shù)生長期生長狀態(tài)良好、存活率較高(90％以上)且致密度約為70％～80％的SW480細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液，PBS洗1次，0.25％胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，每組6個(gè)復(fù)孔，按1×105個(gè)/孔接種細(xì)胞于96孔板上，培養(yǎng)24 h后，3-MA藥物組加入含3-MA的培養(yǎng)基(終濃度為5 μmol/L)，對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，后每孔加入10 μL CCK-8試劑，37℃繼續(xù)孵育培養(yǎng)3 h，酶標(biāo)儀測450 nm光吸收值(OD值)。計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(％)= (加藥孔OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白孔值OD值)×100％。

1.2.3細(xì)胞凋亡率檢測取對(duì)數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，經(jīng)消化后制成單細(xì)胞懸液，每組6個(gè)復(fù)孔，按5×106個(gè)/孔接種細(xì)胞于96孔板上，細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組用藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌2次后，離心棄去上清后，加入500 μL染色緩沖液，然后加入5 μL Annexin-FITC試劑和10 μL PI，混勻，室溫下避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4免疫組化檢測Jagged-1蛋白在各組中的表達(dá)6孔板中置入預(yù)先處理過的無菌蓋玻片，將制備好的細(xì)胞懸液加入6孔板中，使得每個(gè)孔中細(xì)胞量約為1×105/2 mL培養(yǎng)基，放置于37℃、5％ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后各組加入相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出6孔板，用PBS輕柔地流水沖洗3次;然后4％的PFA(多聚甲醛)2 mL室溫固定15 min;去除PFA，細(xì)胞用PBS清洗1次;采用免疫組化SP二步法檢測，步驟參照試劑盒說明書操作。用PBS做空白對(duì)照，已多次檢測為陽性的標(biāo)本做陽性對(duì)照，Jagged-1抗體稀釋濃度為1∶100，抗體孵育為37℃1 h，用IPP 6.0行結(jié)果分析。

1.2.5Western blot檢測Jagged-1蛋白在各組中的表達(dá)蛋白的提取:對(duì)照組和3-MA藥物組用藥處理后培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，每瓶加入120 μL預(yù)先冷卻的細(xì)胞裂解液(RIPA)，混勻，冰浴下?lián)u動(dòng)15 min進(jìn)行裂解，預(yù)冷的離心機(jī)中以14 000 r/min速度離心15 min，取上清轉(zhuǎn)移入新的離心管中-80℃保存待用。BCA法測蛋白濃度。用4×上樣緩沖液將蛋白稀釋成相同濃度，沸水中煮3 min，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ?0 μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠(分離膠10％，濃縮膠5％)在4℃條件下電泳，恒流(20 mA分離膠，然后60 mA恒定電流電泳至溴酚藍(lán)剛出膠底部); 30 mA恒流條件下，4℃轉(zhuǎn)移過夜。5％的BSA封閉1 h;加一抗(1∶500))，4℃過夜;37℃復(fù)溫2 h，TBST洗膜(5 min×3次)，加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(稀釋比為1∶4 000)，37℃孵育2 h; TBST洗膜(5 min×3次); ECL顯像，凝膠成像儀照相，用Quantity One行結(jié)果分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0軟件和GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。每次隨機(jī)試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)6次，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較組間差異，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.13-MA對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞Jagged-1蛋白表達(dá)的影響

免疫組化表明Jagged-1蛋白在結(jié)直腸腺癌細(xì)胞SW480中高表達(dá)，但經(jīng)3-MA處理后，Jagged-1的表達(dá)明顯受到抑制，大多數(shù)細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，t = 17.84)(圖1)。Western blot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，3-MA顯著抑制了結(jié)直腸腺癌細(xì)胞SW480中Jagged-1蛋白的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，t =45.38)(圖2)。

2.23-MA對(duì)細(xì)胞增殖的影響

3-MA對(duì)SW480細(xì)胞增殖活性具有抑制作用，其增殖率為(85.23％±5.61％)，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，t = 8.64)，表明3-MA有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用(圖3)。

2.33-MA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，3-MA對(duì)SW480細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，3-MA處理后的SW480細(xì)胞凋亡率為(11％±4.3％)，與對(duì)照組(4.5％±2.1％)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，t = 6.43)，表明3-MA有促進(jìn)抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用(圖3)。

圖1　3-MA對(duì)SW480細(xì)胞中Jagged-1蛋白表達(dá)的影響（免疫組化染色，×400）*P<0.05，與對(duì)照組比較。

圖2　3-MA對(duì)SW480細(xì)胞中Jagged-1蛋白表達(dá)的影響（Western blot）*P<0.05，與對(duì)照組比較。

圖3　3-MA對(duì)SW480細(xì)胞增殖率和凋亡率的影響

3　討論

Notch是進(jìn)化高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，由受體和相應(yīng)配體組成，Jagged-1是第一個(gè)被證實(shí)的Notch配體，能結(jié)合Notch1、Notch2和Notch4，當(dāng)Jagged-1與相應(yīng)配體結(jié)合后，在γ-分泌酶的介導(dǎo)下Notch的胞內(nèi)段裂解，最終釋放其活性片段NICD (Notch-1 intracellular domain)，經(jīng)核定位序列介導(dǎo)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，激活其下游靶基因如Hes1、hey、CyclinD1和c-Myc等的表達(dá)［4-6］，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織中有Jagged-1的高表達(dá)［7-9］。在結(jié)直腸癌中的研究表明Jagged-1的高表達(dá)與其結(jié)直腸癌細(xì)胞的分化及轉(zhuǎn)移有密切相關(guān)［9］;沉默Jagged-1基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，能抑制腫瘤細(xì)胞的分化和侵襲能力［10］。在前列腺癌中的研究表明的高表與其惡性程度、淋巴轉(zhuǎn)移，細(xì)胞分化程度等成正相關(guān)［8］。我們?cè)谇捌谂R對(duì)結(jié)直腸癌患者標(biāo)本，檢測了Jagged-1的表達(dá)情況［11］，也得到一致的研究結(jié)果。Notch信號(hào)通路的調(diào)控非常復(fù)雜，其中Jagged-1表達(dá)量的變化是其重要的調(diào)節(jié)機(jī)制，但機(jī)體通過何種機(jī)制調(diào)控Jagged-1量的變化，目前尚不清楚。

自噬作為一種高度保守的細(xì)胞行為，指細(xì)胞在缺乏營養(yǎng)和能量供應(yīng)時(shí)，部分細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞器被包裹進(jìn)一種特異的雙層膜或者多次膜結(jié)構(gòu)的自噬體中，形成的自噬體在與溶酶體融合形成自噬溶酶體，胞質(zhì)和細(xì)胞器成分在這里被降解為核苷酸，氨基酸、游離脂肪酸等小分子物質(zhì)，這些小分子物質(zhì)可以重新被利用合成大分子或者ATP［12］。Jagged-1是否也能夠通過自噬活性來實(shí)現(xiàn)自身量的調(diào)節(jié)，目前尚不清楚。最近在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)參與自噬前體穩(wěn)定的基因danc，其突變能抑制自噬的發(fā)生并表現(xiàn)為翅緣缺口(Notch基因的表型)，添加該基因時(shí)能取消上述效果［13］，表明自噬可能通過調(diào)節(jié)Notch信號(hào)活性通路發(fā)揮生物學(xué)作用，為此本研究采用經(jīng)典自噬抑制劑3-MA抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的自噬活性，檢測其對(duì)Jagged-1表達(dá)的影響，明確自噬抑制劑3-MA能否通過改變Jagged-1的表達(dá)量發(fā)揮其生物學(xué)功能。本研究結(jié)果顯示結(jié)直腸癌腺癌細(xì)胞經(jīng)3-MA作用后Jagged-1蛋白表達(dá)較對(duì)照顯著下降，而非上升，表明自噬抑制劑3-MA降低Jagged-1蛋白的表達(dá)量，可能不是其通過對(duì)細(xì)胞自噬活性改變來實(shí)現(xiàn)的，可能是通過其他機(jī)制。最近有研究表明3-MA的抗癌活性與細(xì)胞的自噬活性無關(guān)，支持本研究結(jié)果［14］，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究;同時(shí)3-MA對(duì)結(jié)直腸腺癌細(xì)胞增殖活性的檢測表明3-MA本身具抗腫瘤作用，推測其抗腫瘤作用可能主要是通過抑制腫瘤關(guān)鍵生存信號(hào)通路如Notch等提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(學(xué)術(shù)編輯:王崇樹)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2015-3-5 12∶47網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150305.1247.014.html

Effect of 3-methyladenine on expression of Jagged-1 and cell proliferation in colorectal cancer cell

XIE Jie-bin1，PANG Yue-shan2，WANG Chong-shu1，WEI Shou-jiang1，WANG Pan1，TANG Jing1

(1.Department of Gastrointestinal Surgery，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Institute of Hepatobiliary and Pancreatic Intestinal Disease;2.Department of Pain Management，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: To investigate the effects of 3-methyladenine on the expression of Jagged-1 and cell proliferation in colorectal cancer cell.Methods: The expression of Jagged-1 protein was investigated by immunohistochemical staining and Western blot; the cell proliferation of colorectal cancer cell line SW480 measured by CCK8; apoptosis rate was detected by double Annexin/PI staining.Results: Compared with the control group，the expression of Jagged-1 protein was obviously inhibited as a result of immunohistochemical staining and wester blot(P＜0.05); After treated by 3-Methyladenine，the cell proliferation rate of colorectal cancer cell was (85.23±5.61)％ which was obviously lower than the control group; The 3-MA treated group apoptosis rate was(11±4.3)％ which was obviously higher than the control group(4.5±2.1)％(P＜0.05).Conclusion: The antitumor effect of 3-MA may inhibite proliferation and promote apoptosis on colorectal cancer cell through inhibiting the expression of jagged-1 protein.

【Key words】Jagged-1; Colorectal cancer; Autophagy;3-methyladenine

作者簡介:謝杰斌(1984-)，男，四川南充人，碩士，助教，主要從事消化道腫瘤的基礎(chǔ)與臨床，糖尿病外科治療。E-mail: xiejiebin84@126.com

基金項(xiàng)目:四川省教育廳基金項(xiàng)目(13ZB0243);川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(CBY12-A-QN20)

收稿日期:2014-06-26

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.01.14

【文章編號(hào)】1005-3697(2015)01-0060-04

【中圖分類號(hào)】R735.3

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A