潘家義，周勝華，黃 峰，白忠樂

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，貴陽 550004；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心內(nèi)科，長沙 410011)

論著·基礎(chǔ)研究

MSCs 2種分離培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)液中的VEGF、SDF-1α濃度比較*

潘家義1，周勝華2△，黃 峰2，白忠樂2

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，貴陽 550004；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心內(nèi)科，長沙 410011)

目的 通過2種分離培養(yǎng)方法所得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的生長特征和微環(huán)境中細(xì)胞因子的比較，提供一種可以快速、安全、高效地為臨床和實驗提供大量優(yōu)質(zhì)MSCs的方法。方法 提取C57BL/c小鼠的骨髓，分別作密度梯度離心法和全骨髓貼壁培養(yǎng)分離法分離培養(yǎng)MSCs，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD29+、CD31-、CD34-、CD45-表達(dá)水平，并比較各自所得細(xì)胞的生長曲線；ELISA檢測培養(yǎng)液中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、SDF-1α濃度并比較二者的差異。結(jié)果 與密度梯度離心法比較，全骨髓貼壁分離法所得原代細(xì)胞有較快的生長速度，較短的生長周期；培養(yǎng)液中VEGF和SDF-1α濃度也稍高于密度梯度離心法。結(jié)論 全骨髓貼壁培養(yǎng)法可以快速、方便、有效地為臨床和實驗提供大量MSCs，所得細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)于密度梯度離心法，減少了對細(xì)胞功能的損害。

密度梯度離心法；全骨髓貼壁分離法；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是具有多向分化潛力的非造血干細(xì)胞，由于具有低免疫源性和取材方便等特點，成為缺血心臟病干細(xì)胞治療的首選干細(xì)胞。目前，提取骨髓MSCs方法包括全骨髓貼壁分離法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀和免疫磁珠分離法。后二者由于提取過程中MSCs功能受到很大影響，費用昂貴，很難方便、快速地為臨床提供大量MSCs，因此，全骨髓貼壁分離法、密度梯度離心法才是比較常用的提取方法。Xue等利用富含血小板的血漿代替胎牛血清來培養(yǎng)MSCs，認(rèn)為這種血漿為MSCs提供了更為有益、安全的生長條件；Lucarelli等[1]證實富含血小板的血漿中含有不同濃度的、微量的各種生長因子。凡此種種嘗試讓作者提出了培養(yǎng)微環(huán)境的概念，不少文獻也證實了少量生長因子可以為MSCs營造適宜生長環(huán)境，促進其增殖。本研究比較了密度梯度離心法和全貼壁離心法，并將培養(yǎng)液中生長因子濃度作比較，試圖從微環(huán)境的角度評價2種方法的優(yōu)劣。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡C57BL/c小鼠(由湖南省斯萊克達(dá)實驗動物有限公司提供)。

1.1.2 試劑 小鼠干細(xì)胞細(xì)胞分離液(中國生命科學(xué)院)，青霉素、鏈霉素(CLONTECH公司)，低糖DMEM(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶(美國Sigma公司)，兔抗鼠CD31FITC抗體、兔抗鼠CD45 FITC抗體、兔抗鼠CD29 FITC抗體、兔抗鼠CD34 FITC抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 C57BL/c小鼠骨髓MSCs分離、培養(yǎng)的2種方法 取6周齡C57BL/c小鼠4只，體質(zhì)量16～20 g，用10%的水合氯醛麻醉致死，浸泡在75%乙醇中進行表面消毒5～10 min；在工作臺無菌操作下切開皮膚、分離皮下組織、肌肉，暴露股骨、脛骨；截取脛骨和股骨，剪去干骺端，使用裝有消毒磷酸鹽緩沖液(PBS)的1 mL一次性無菌注射器反復(fù)沖洗骨髓腔4～5遍，直到骨髓腔變?yōu)榘咨?1)密度梯度離心法：將沖洗液小心加入到2倍體積小鼠干細(xì)胞細(xì)胞分離液Percol分離液的表面，28 ℃下2 000 r/min離心15 min，小心吸取第2層的細(xì)胞，移入另一試管，加入2 mL PBS，28 ℃下1 000 r/min離心5 min，沖洗MSCs，倒掉上清液，加入含有15% PBS、鏈霉素100 U/mL、青霉素100 U/mL的低糖DMEM培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，滴一小滴細(xì)胞懸液于血小板計數(shù)儀上計數(shù)，配成約1×106個/mL的細(xì)胞密度，接種于塑料培養(yǎng)瓶中。置于37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)。(2)全骨髓貼壁培養(yǎng)方法：將沖洗液小心加入離心管，28 ℃下2 000 r/min離心15 min；倒掉上清液，如上述方法加入培養(yǎng)液(細(xì)胞密度1×106個/mL)，接種于塑料培養(yǎng)瓶中。置于37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)。

1.2.2 骨髓MSCs的擴增和傳代 待MSCs長到80%～90%融合時，傾倒出瓶中培養(yǎng)液，用PBS液沖洗3次，滴入0.25%胰蛋白酶消化液，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中消化2 min。顯微鏡下可見細(xì)胞脫壁、團縮變圓，滴入10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，吹打、輕拍瓶底后，收細(xì)胞入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入上述培養(yǎng)液4 mL，吹打管底，制成細(xì)胞懸液，按細(xì)胞密度1×106個/mL，重新接種到培養(yǎng)瓶中，按1∶2的比例進行傳代。置入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞生長曲線制作 (1)準(zhǔn)備好計數(shù)板，取生長狀態(tài)良好的P3代細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞以4×104個/mL的密度接種在24孔培養(yǎng)板內(nèi)，共接種24個孔，每孔加入培養(yǎng)液0.2 mL。接種后第2天開始每隔24 h對3個孔的細(xì)胞稍作胰酶消化，制成混懸液，再利用計數(shù)板進行計數(shù)細(xì)胞，共計數(shù)8 d；以培養(yǎng)時間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，描繪在半對數(shù)坐標(biāo)上。連接成曲線后即成該細(xì)胞的生長曲線。

1.2.4 流式細(xì)胞儀骨髓MSCs表面抗原鑒定 收集C57BL/c小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞至少3瓶(1×106個/mL細(xì)胞密度)，倒掉培養(yǎng)基，用PBS液沖洗2遍，加入消化酶1 mL，37 ℃孵育2 min，輕拍后加入培養(yǎng)基3 mL終止消化，收集細(xì)胞至15 mL離心管，900 r/min離心8 min，棄上清液，PBS 6 mL重懸，重復(fù)離心再棄上清液，用450 μL重懸，取6 μL出來稀釋10倍，計數(shù)細(xì)胞液濃度為1×105個/mL為好，取500 μL細(xì)胞懸液分入5個流式管(此后均避光)，各管分別加入FITC標(biāo)記CD29、CD34、CD31、CD45抗體各20 μL，一管作為空白對照，4 ℃避光孵育30 min，各管內(nèi)加入600 μL PBS液，彈均或吹均，1 500 r /min離心8～9 min，棄上清液，若細(xì)胞數(shù)可達(dá)106個/管，則加300 μL PBS液重懸，吹均，若不能達(dá)此數(shù)目，可酌情加入100～200 μL，于流式儀機上分析，檢測熒光值。

1.2.5 ELISA法檢測培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、SDF-1α的濃度 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL于反應(yīng)孔、加入待測樣品50 μL于反應(yīng)孔內(nèi)，立即加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，混勻，37 ℃溫育1 h；甩去孔內(nèi)液體，加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干并重復(fù)3次。每孔加入80 μL的親和酶素-HRP混勻，37 ℃溫育30 h。再次甩去洗滌液、拍干3次(方法同前)。每孔加入底物A、B各50 μL，混勻，37 ℃溫育10 min，避光。取出酶標(biāo)板，加入50 μL終止液后測定結(jié)果。在450 nm波長處測定各孔的光密度(OD)值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值指定標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各檢測樣本的OD值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出各樣本濃度。

2 結(jié)果

2.1 2種方法取得MSCs的形態(tài)觀察 細(xì)胞接種培養(yǎng)瓶24 h后，倒置相差顯微鏡下觀察，可見大量懸浮細(xì)胞存在，全骨髓貼壁培養(yǎng)法經(jīng)過2～3次換液后可去除懸浮細(xì)胞，可見貼壁細(xì)胞中有單個或幾個細(xì)胞呈短棒狀變化；觀察中可見全骨髓貼壁原代培養(yǎng)時，經(jīng)幾次換液后瓶底可見更多棒狀細(xì)胞并漸出現(xiàn)較為集中的集落，一般第2～5天為生長潛伏期，細(xì)胞增殖較慢，第6～14天為細(xì)胞的快速增殖期，集落中的細(xì)胞不斷增殖并逐漸增大變形，并向附近遷移擴大，較大集落可見細(xì)胞呈梭形且作放射狀排列，15～18 d細(xì)胞融合可達(dá)90%；密度梯度離心法所得細(xì)胞有更長的生長周期，增殖明顯慢于全骨髓貼壁培養(yǎng)法，有的要達(dá)90%融合可能需要3～4周時間，方法差別的影響可以影響2～4代，此后差別慢慢消失。細(xì)胞生長也漸趨均勻一致，可呈菊花狀和放射狀生長(圖1～8)。

圖1 密度梯度離心P0D1(×20)

圖2 全骨髓貼壁培養(yǎng)剛從骨髓P0D0(×20)

2.2 流式細(xì)胞儀鑒定骨髓MSCs的表面抗原 流式細(xì)胞儀表面抗原分析結(jié)果，檢測顯示培養(yǎng)第3代細(xì)胞表面抗原陽性表達(dá)率分別為CD29(93.02%)、CD45(5.71%)、CD31(9.51%)、CD34(4.57%)，則所得細(xì)胞陽性表達(dá)CD29，陰性表達(dá)CD45、CD31、CD34，與以往文獻報道的MSCs表達(dá)的表面抗原特征相符,見圖9～12。

圖3 密度梯度離心P0D3(×20)

圖4 全骨髓貼壁培養(yǎng)剛從骨髓P0D3(×20)

圖5 密度梯度離心P0D7(×20)

2.3 骨髓MSCs的生長曲線 原代代細(xì)胞培養(yǎng)有較長的生長周期，全骨髓貼壁分離培養(yǎng)法可見有較快的增長速度；4代后兩組細(xì)胞潛伏期均縮短為2 d左右，從第3天起細(xì)胞增殖開始加快，進入指數(shù)增殖期，至第6～7天，細(xì)胞增殖速度再次減慢，處于增殖平臺期，第4～12代生長曲線漸趨一致(圖13)。多次傳代后細(xì)胞增殖緩慢，細(xì)胞變得闊大，折光性變差，細(xì)胞凋亡逐漸增多。

圖6 全骨髓貼壁P0D7(×20)

圖7 密度梯度離心P3D16(×20)

圖8 全骨髓貼壁P3D12(×20)

2.4 2、3代細(xì)胞培養(yǎng)液中的VEGF、SDF-1α的變化 留取2、3代細(xì)胞培養(yǎng)換液時的培養(yǎng)液作ELISA檢測其中VEGF、SDF-1α的濃度，可見培養(yǎng)液中始終維持著低濃度的VEGF、SDF-1α。全骨髓貼壁培養(yǎng)組的細(xì)胞培養(yǎng)液中的VEGF、SDF-1α平均濃度均高于密度梯度離心組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。全骨髓貼壁培養(yǎng)組、密度梯度離心組比較，可見培養(yǎng)第3天的VEGF、SDF-1α濃度低于第5天和第7天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而第5天、第7天的VEGF、SDF-1α濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖12～13、表1。

圖9 CD34-

圖10 CD45-

圖11 CD29+

表1 2種方法細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF、SDF-1α濃度比較

★：P<0.01，與第3天時比較。

圖12 CD31-

圖13 不同方法所得MSCs的不同生長曲線

3 討論

骨髓MSCs是有著多向分化潛力的非造血干細(xì)胞，可以分化成脂肪、骨骼肌、骨、軟骨和結(jié)締組織細(xì)胞，也能夠分化成心肌細(xì)胞，這一點對心臟修復(fù)是很有吸引力的，因而，其在缺血性心臟病干細(xì)胞治療中研究較多。除具有自我更新和多向分化潛能外，該干細(xì)胞還具有來源充足、細(xì)胞培養(yǎng)成活率高、低免疫排異反應(yīng)、易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)等優(yōu)點，因此，引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注。但人骨髓中的MSCs水平極低，在骨髓單核細(xì)胞所占比例僅為0.01%，難以滿足組織工程學(xué)的需要。因此，需選擇最有效率的方法進行體外擴增也成為干細(xì)胞治療最為關(guān)注的一方面。

本研究將Friedenstein等[2]建立的全骨髓貼壁細(xì)胞分離法和密度梯度離心法做了比較，發(fā)現(xiàn)密度梯度離心法也可以有效地將紅細(xì)胞、白細(xì)胞、單核細(xì)胞分層且對細(xì)胞活性影響較小，但也破壞了MSCs生長的骨髓微環(huán)境；而全骨髓貼壁分離法操作簡便、快速；雖然所得細(xì)胞成分復(fù)雜，卻可以根據(jù)MSCs貼壁生長而造血細(xì)胞懸浮生長的特性對二者進行分離，對細(xì)胞活性影響小,且由于保留了骨髓中有利于生長的細(xì)胞因子和促黏附物質(zhì)，有著更為適宜的干細(xì)胞生長微環(huán)境，促使MSCs生長增殖旺盛，并且經(jīng)換液傳代2～3代后細(xì)胞純度可達(dá)到98%以上。

骨髓MSCs培養(yǎng)的適宜環(huán)境研究一直是眾多研究者關(guān)心的問題，包括選擇適宜培基、適宜的細(xì)胞接種密度、各種信號分子對骨髓MSCs的增殖分化影響等。目前，研究培養(yǎng)基有α-MEM、L-DMEM、IMDM等,其中，以L-DMEM和α-MEM為佳。本研究采用L-DMEM和10%的胎牛血清獲得了較好的培養(yǎng)效果。另外，首次接種密度也很重要，接種密度太低會影響細(xì)胞間信息傳遞而使細(xì)胞生長受限，本實驗首次接種密度一般在4.0×105～6個/mL左右。目前，對于首次換液的時間目前無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本培養(yǎng)法采用12 h后全量換液，這樣便于更好地去除懸浮細(xì)胞，得到更為純化的原代細(xì)胞。原代細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞初成圓形，貼壁后呈梭形、多邊形、集落樣生長。本研究中，全骨髓貼壁分離法約生長14～18 d左右可達(dá)80%～90%細(xì)胞融合，可進行傳代；而密度梯度離心法則需3～4周左右可達(dá)80%～90%細(xì)胞融合，甚至更長，傳3、4代后生長特性方漸趨相近。本研究還觀察到全骨髓貼壁法所得MSCs傳至10代仍可保持旺盛的生長，而密度梯度離心法細(xì)胞則變得寬大、折光性差。本研究認(rèn)為2種方法表現(xiàn)出的不同生長特性和其兩者的細(xì)胞生長微環(huán)境的差異有關(guān)。

MSCs培養(yǎng)中可以自分泌或旁分泌各種細(xì)胞因子、黏附分子、生長因子，構(gòu)成了培養(yǎng)中的微環(huán)境，促進MSCs增殖和分化。據(jù)研究，MSCs可以分泌表達(dá)IL-1、IL-6、SDF-1α、FGF、EGF等[3]。Lucarelli等[1]實驗顯示FGF、EGF、PDGF信號促進了MSCs的生長，無這些生長因子，細(xì)胞生長緩慢、形態(tài)扁平，可向纖維母細(xì)胞發(fā)展[4]。另有研究表明IGF可提高增殖速度，并縮短對數(shù)增長時間，而且這種促進作用呈濃度依賴性[5]。MSCs分泌的各種細(xì)胞因子也可促進細(xì)胞遷移分布，不同的生長因子對細(xì)胞特異分化方向也有重要意義，例如FGF和TGF在向軟骨細(xì)胞分化中起著一定作用[6]，而VEGF可促進MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，有利于傷口或損傷的愈合[7]。本研究在可見全骨髓貼壁培養(yǎng)組的VEGF、SDF-1α等的分泌水平高于密度梯度離心分離組，這也說明了密度梯度離心方法對MSCs細(xì)胞功能活性有一定的負(fù)面影響，考慮與分離液和高速離心對細(xì)胞的損害有關(guān)。步驟復(fù)雜、提取時間較長也會使得一部分MSCs在這過程中失活、死亡。因此，密度梯度離心組的細(xì)胞要達(dá)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞融合度需更長的生長周期。實驗中還觀察到兩組細(xì)胞始終維持著低濃度的VEGF、SDF-1α，相信這對培養(yǎng)細(xì)胞維持持續(xù)的增長有重要的意義。對那些MSCs培養(yǎng)失敗個別培養(yǎng)板做生長因子檢測，發(fā)現(xiàn)在最初的幾天VEGF、SDF-1α可以維持一定的濃度，此后的過程中發(fā)現(xiàn)其VEGF、SDF-1α濃度漸漸下降，細(xì)胞生長也難以維持。因此，有研究者嘗試在培養(yǎng)液中適當(dāng)加以各種生長因子如VEGF、IGF、FGF、SDF-1α[8-9]，可促進MSCs自分泌和旁分泌的作用，也大大促進其增殖生長，成效可見。但有研究者認(rèn)為，MSCs在特定環(huán)境中有一定的生長因子分泌模式，某一因子分泌過多會促使其向特定細(xì)胞群分化，例如成脂分化、成骨細(xì)胞分化[10-12]等，而且生長因子會對MSCs的表型產(chǎn)生的怎樣影響也需進一步探討。微環(huán)境是MSCs增殖生長的土壤，MSCs通過旁分泌自分泌各種生長因子為自身營造最佳環(huán)境，密度梯度離心過程中，各種因素對細(xì)胞的損害，也傷及其自分泌旁分泌的作用，使得在其后的生長中難以營造最佳微環(huán)境。另外，有報道認(rèn)為全骨髓貼壁會增加污染的機會，這一點與作者觀察的相反，本研究中密度梯度離心卻表現(xiàn)更多污染率，可能與復(fù)雜的過程、提取時間過長有關(guān)，本研究則認(rèn)為污染與操作的過程和培養(yǎng)環(huán)節(jié)有關(guān)。

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Comparison of isolation ways of MSC and VEGF and SDF-1α concentration in respective culture medium*

PanJiayi1,ZhouShenghua2△,HuangFeng2,BaiZhongle2

(1.DepartmentofCardiology,theAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang,Guizhou550004,China;2.DepartmentofCardiology,theSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha,Hunan410011,China)

Objective To choose one protocol that can quickly,safely and effectively provide amount enough of bone marrow derived mesenchymal stem cells(MSCs) for use of clinical or experimental test through comparison of their growth characteristics and growth factors levels in culture solution.Methods Cells extracted from bone marrow of C57BL/C mice respectively underwent two different isolation protocols:whole bone marrow adherent culture(WBMAC) or gradient density separation(GDS);characteristic surface antigens of MSCs were identified by flow cytometry on cells isolated in different ways;the distinct growth curve of primary stem cells cultured in vitro described their different proliferation rate;levels of vascular endothelial growth factor(VEGF) and stromal cell-derived factor-1α(SDF-1α) in culture medium were detected by ELISA.Results Primary MSCs obtained by WBMAC proliferated at higher speed and exhibited shorter growth cycle than those separated by GDS;on MSCs from both groups,surface antigens CD29 were detected positively,and antigens including CD31,CD34 and CD45 were assayed negatively;concentration of VEGF and SDF-1α in both two nutrient solution primarily keep at low levels,comparatively,level of VEGF and SDF-1α in the dishes which contain MSCs by WBMAC was higher than the one in the dishes which contain MSCs by GDS.Conclusion MSCs extracted by WBMAC shows unimpaired cell function,can build automatically more suitable microenviroment for their growth;this classic method was qualified for clinical and experimental use in a safe,rapid,effective way.

BMSCs；whole bone marrow adherent culture；gradient density separation

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.08.003

國家自然科學(xué)基金資助項目(30871053)。 作者簡介：潘家義(1973-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事心臟病研究。△

，Tel：13707483674；E-mail：zhougqin@21cn.com。

R329

A

1671-8348(2015)08-1017-05

2014-10-16

2014-12-25)