李宜培， 尚俊杰， 王 黎

(1.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 病理生理學(xué)教研室，鄭州 451191； 2.鄭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450001； 3.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 老年學(xué)研究所，鄭州 451191)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

EPO對Aβ1-42所致AD樣大鼠皮層神經(jīng)元樹突棘的影響*

李宜培1， 尚俊杰2， 王 黎3△

(1.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 病理生理學(xué)教研室，鄭州 451191； 2.鄭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450001； 3.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 老年學(xué)研究所，鄭州 451191)

目的 探討erythropoietin(EPO)對Aβ1-42所致AD樣大鼠記憶能力和皮層神經(jīng)元樹突棘的影響及作用機(jī)制。方法 雄性Wistar大鼠48只隨機(jī)分為4組：生理鹽水組、模型組、EPO治療組和腦復(fù)康陽性對照組，每組12只。其中生理鹽水組雙側(cè)海馬注射生理鹽水各5 μL，其余3組大鼠雙側(cè)海馬注射凝聚態(tài)β-淀粉樣蛋白(Aβ)各5 μL造模。EPO治療組和腦復(fù)康陽性對照組從造模手術(shù)當(dāng)天開始腹腔注射EPO(5 000 IU/kg,隔日一次)和腦復(fù)康(40 mg/kg,每日一次)。術(shù)后第10天Morris水迷宮法檢測各組大鼠空間定向?qū)W習(xí)和記憶能力；利用高爾基染色、連續(xù)震蕩切片和人工計(jì)數(shù)的方法，分析各組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元樹突棘量的改變情況。結(jié)果 與生理鹽水組、EPO治療組及腦復(fù)康組相比，模型組水迷宮測試潛伏期延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與生理鹽水組相比，模型組皮質(zhì)神經(jīng)元樹突棘數(shù)目數(shù)目減少，EPO治療組及腦復(fù)康對照組數(shù)目明顯多于模型組(P<0.05)；而EPO治療組及腦復(fù)康對照組相比則無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論 EPO可以減輕Aβ1-42對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元樹突棘的破壞，提高大鼠認(rèn)知能力。

促紅細(xì)胞生成素；Alzheimer’s disease；神經(jīng)元樹突棘； Morris水迷宮

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種老年患者常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]，其主要病理學(xué)特征為神經(jīng)細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid peptide，Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaque,SP)、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)異常磷酸化的tau蛋白聚集所形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)以及皮質(zhì)、海馬選擇性的神經(jīng)元變性和缺失[2]。Aβ是老年斑的主要組成成分，被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能障礙的主要原因[3]。近年來研究表明，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)在腦損害中發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護(hù)作用[4]。為探討EPO在AD治療中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠海馬注射凝聚態(tài)Aβ1-40的方法復(fù)制AD動物模型[5]，通過腹腔注射重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHu-EPO)，觀察EPO對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及皮質(zhì)神經(jīng)元樹突棘量的改變情況，初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理 雄性2月齡Wistar大鼠55只,清潔級,體質(zhì)量250～300 g，動物批號：SCXK(豫)2005-2001，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。Morris水迷宮法篩選后，淘汰反應(yīng)過于靈敏和遲鈍的7只大鼠后，48只大鼠隨機(jī)分為4組：生理鹽水組、模型組、EPO治療組和腦復(fù)康陽性對照組，每組12只。動物自由飲食，晝夜交替飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度15～20 ℃。

1.2 主要試劑和儀器 Aβ1-40 (美國Sigma公司)，rHu-EPO(上海克隆生物高技術(shù)有限公司)，骨蠟(上海三友醫(yī)療器械有限公司)。0.5%亞硝酸鈉生理鹽水、10%甲醛生理鹽水、1%AgNO3溶液、媒染液(水合氯醛25 g，重鉻酸鉀25 g，雙蒸水250 mL溶解后加甲醛50 mL，最后用雙蒸水定容至500 mL)均購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；腦立體定位儀(ZH-藍(lán)星B，安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)，Morris水迷宮系統(tǒng)(DMS-2型，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，恒溫培養(yǎng)箱(GSP-9080MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，電子天平(瑞士METTLER TOLEDO)。

1.3 Aβ1-40孵育 將1 mg Aβ1-40溶于500 μL磷酸鹽緩沖液，稀釋為2 g·L-1的濃度，置于37 ℃恒溫箱中連續(xù)孵育12 d，使蛋白充分伸展形成聚合態(tài)，然后4 ℃保存使用，忌反復(fù)凍融。

1.4 大鼠模型的建立 用體積分?jǐn)?shù)6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300 mg·kg-1)后將其固定于腦立體定位儀上。參照《大鼠腦立體定位圖譜》[6]進(jìn)行定位：以前囟為原點(diǎn)，向后4．0mm，中線旁2.0～2.5 mm，顱骨鉆孔后進(jìn)針3．0～3.5 mm。用微量進(jìn)樣器施行注射，每只大鼠注射5 μL。生理鹽水組按照模型組方法在海馬注射生理鹽水 5 μL。EPO治療組大鼠在正常喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上從造模手術(shù)當(dāng)天開始腹腔注射5 000 IU·kg-1rHu-EPO，隔日1次,共5次。腦復(fù)康陽性對照組從造模手術(shù)當(dāng)天開始腹腔注射腦復(fù)康40 mg·kg-1,每日一次，共10次。

1.5 Morris水迷宮行為學(xué)測試 Morris水迷宮由水迷宮裝置、圖像自動采集和分析處理系統(tǒng)組成。水迷宮分為4個(gè)象限，與平臺所在象限相對立的象限為第一象限。訓(xùn)練時(shí)，大鼠從任一象限面向池壁入水，記錄大鼠潛伏期(即從入水到四肢爬上平臺所需的時(shí)間)，圖像采集系統(tǒng)拍攝其游泳軌跡。大鼠每天在每個(gè)象限學(xué)習(xí)4次，每次時(shí)限為60 s，即在60 s內(nèi)大鼠未找到平臺者停止記錄，潛伏期記為60 s,大鼠由測試者引導(dǎo)站立平臺上，持續(xù)10 s。大鼠從平臺上取下，休息30～60 s后再進(jìn)行下一次訓(xùn)練。記錄第一象限的潛伏期為實(shí)驗(yàn)成績。該實(shí)驗(yàn)從第31天連續(xù)訓(xùn)練大鼠7 d，記錄第7天的潛伏期成績來反映大鼠的空間記憶能力。

1.6 高爾基染色 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取2只做高爾基染色檢查，觀察樹突棘數(shù)目及結(jié)構(gòu)。大鼠用6%水合氯醛麻醉后，剪開胸腔，灌流針由心尖部朝主動脈起始處方向刺入，開始灌流?？焖儆?00 mL 0.5%亞硝酸鈉生理鹽水灌流后；10%甲醛生理鹽水繼續(xù)灌流，速度先快后慢，時(shí)間控制在2～3 h；最后換上媒染液，速度先快后慢，時(shí)間約4～5 h。灌流結(jié)束后，取出腦組織，剝離海馬置入媒染液中，避光浸泡3 d(常溫：20～37 ℃)，每天更換媒染液；3 d后，用1%硝酸銀置換(置換前先用蒸餾水沖洗一下，再用硝酸銀漂洗3次，每次5 min，連續(xù)3 d。

3 d后，震蕩切片，震蕩切片機(jī)的盒中為2%重鉻酸鉀溶液，撈片后用蒸餾水漂洗30 min； 1%明膠鋪片,室溫下約10 min晾干后進(jìn)行梯度脫水透明，完畢后用中性樹膠封片，油鏡觀察樹突棘數(shù)目及觀察，照像。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)神經(jīng)元樹突棘的檢測 皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞有 1 個(gè)頂樹突，由胞體的頂端發(fā)出，頂樹突在分支前可稱為初級樹突,初級樹突較短,無樹突棘。初級樹突分支形成2～3條次級樹突,次級樹突較長,有少量樹突棘,它沿途可發(fā)出3級樹突。3 級樹突偶爾可分支形成 4 級樹突。樹突棘(dendritic spine)是樹突表面的棘狀突起，形態(tài)各異，有細(xì)長形、樹樁形、蘑菇形、杯子形等。

2.2 樹突棘的變化 高爾基染色結(jié)果：生理鹽水組樹突棘形態(tài)規(guī)則，排列整齊且密集，樹突棘數(shù)目是(1.36±0.18)個(gè)/μm ，與之相比， AD模型組樹突棘個(gè)數(shù)為(0.74±0.19)個(gè)/μm，明顯減少；rHu-EPO治療組及腦復(fù)康對照組樹突棘數(shù)目分別為(1.63±0.15)個(gè)/μm和(1.46±0.25)個(gè)/μm，與AD模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與生理鹽水組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 高爾基染色: 各實(shí)驗(yàn)組皮質(zhì)神經(jīng)元樹突棘比較

A 生理鹽水組；B 模型組； C EPO治療組； D 腦復(fù)康治療組

3 討論

樹突棘是神經(jīng)元之間形成突觸連接和信息傳遞的部位，也是神經(jīng)元適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境變化的調(diào)節(jié)部位，有較強(qiáng)的可塑性，與大腦高級功能密切相關(guān)，樹突棘的功能和結(jié)構(gòu)的可塑性被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的細(xì)胞基礎(chǔ)。樹突棘作為學(xué)習(xí)記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)，其穩(wěn)定性對學(xué)習(xí)記憶至關(guān)重要，樹突棘的結(jié)構(gòu)性病理學(xué)改變可改變突觸的功能，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知缺陷[7]。在腦的神經(jīng)活動中，90%以上的興奮傳導(dǎo)是通過樹突棘進(jìn)行的。樹突棘是構(gòu)成興奮性突觸的突觸后結(jié)構(gòu)，樹突棘的減少提示衰老動物海馬CA1區(qū)軸-棘突觸數(shù)目的減少，這很可能是導(dǎo)致衰老動物學(xué)習(xí)記憶減退的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，以往對海馬神經(jīng)元樹突棘數(shù)目隨衰老而減少的研究結(jié)果也進(jìn)一步支持這一觀點(diǎn)[8]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組樹突棘數(shù)量顯著減少， EPO治療組及腦復(fù)康對照組則明顯多于模型組。本次結(jié)果表明Aβ1-42引起的AD樣大鼠模型組空間記憶障礙的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)不是突觸數(shù)量減少，而是突觸功能降低。而EPO治療組及腦復(fù)康對照組空間記憶測試成績明顯提高，其原因可能是EPO可以提高突觸傳遞功能。但基于此的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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[責(zé)任編校：柯 莉]

Effects of EPO on Cortical Neuron Dendritic Spinesof AD Rats Induced by Aβ1-42

LI Yi-pei1， SHANG Jun-jie2, WANG Li3△

(1.Department of Pathophysiology, Henan Medical College, Zhengzhou 451191, Henan China;2.Basic Medical College of Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan China;3.Institute of Gerontology, Henan Medical College, Zhengzhou 451191, Henan China)

Objective To investigate effects of erythropoietin(EPO)on Alzheimer rat’s memory ability and cortical neuron dendritic spines. Method Fourty eight rats complied with learned standard, were randomly divided into four groups(n=12): normal sodium group，model group, EPO treated group and piracetam treatment group. 5 uL normal sodium was injected into bilateral hippocampuses of normal sodium group. 5 uL condensed Aβ was injected into bilateral hippocampuses of other 3 groups. EPO treated groups were injected with 5 000 IU·kg-1EPO once every other day, piracetam treatment groups were injected with 40 mg·kg-1piracetam every day since the day of model operation.At the 10th day after operation, space orientation and memory of rats were assayed by Morris water maze. Analysis of each group rats cortex nerve in yuan to change the amount of dendritic spines useing of golg, continuous turbulence slicing and manual counting method. Results Compared with normal sodium group，EPO treated group and piracetam treatment group, the spatial memory were significantly reduced (P<0.05). Compared with normal sodium group, the numbers of cortical neuron and dendritic spines were reduced in model group, the numbers of cortical neuron and dendritic spines of EPO treated group and piracetam treatment group were increased than model group, but there was no significant differences between EPO treated group and piracetam treatment group (P<0.05). Conclusion EPO can reduce the destruction of the dendritic spines of rat cortical neurons to improve cognitive abilities in rats caused by Aβ1-42.

erythropoietin; Alzheimer’s disease; cortical neuron dendritic spines; Morris water maze

2014-11-30

李宜培(1981-)，女，河南省社旗縣人，碩士，講師，從事病理生理學(xué)教學(xué)與科研。

△通訊作者：王黎，E-mail:kyk02@126.com。

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(編號：201304092)。

R 654.2

A

1008-9276(2015)03-0263-03