任林英， 張祝蘭， 王徳森， 楊煌建， 唐文力， 孫 菲

福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點實驗室，福州350007

微波誘變結(jié)合抗性突變篩選放線菌素D高產(chǎn)菌株

任林英， 張祝蘭?， 王徳森， 楊煌建， 唐文力， 孫 菲

福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點實驗室，福州350007

采用微波結(jié)合鏈霉素抗性篩選法選育放線菌素 D的高產(chǎn)菌株。通過考察鏈霉素對 Streptomyces rubiginosohelvolus FIM-N31菌株孢子生長情況的影響確定鏈霉素致死濃度，出發(fā)菌株FIM-N31的孢子經(jīng)微波輻照處理后，涂布在含鏈霉素致死濃度(50μg/mL)的培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，獲得了大量的鏈霉素抗性基因突變株。搖瓶發(fā)酵篩選突變株，結(jié)果獲得一株遺傳性狀穩(wěn)定的放線菌素D高產(chǎn)菌Str186，其產(chǎn)放線菌素D的能力比出發(fā)菌株提高了8倍以上。

:鏈霉菌；放線菌素D；抗生素抗性篩選；復(fù)合誘變

放線菌素D是一種色素肽內(nèi)酯抗生素，是經(jīng)典的抗腫瘤藥物之一[1～3]，與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用，并配合放射治療能夠取得良好的效果[4～6]，其抗癌作用可能與其色基結(jié)構(gòu)有較為密切的關(guān)系，而其環(huán)肽部分可能起到一種載體的作用[7]。其獨特的環(huán)肽化學(xué)結(jié)構(gòu)、抑制RNA合成的抗腫瘤機(jī)理，以及不易與其他化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥性的特點是化療藥物難得的優(yōu)點，因此，近年來對其研究一直非?；钴S，不斷發(fā)現(xiàn)新的靶點和抗腫瘤作用的新機(jī)制。但天然放線菌素D有較大的毒性，限制了其在臨床上的應(yīng)用范圍，因此對放線菌素D進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造以降低其毒性作用、對不同來源的產(chǎn)生菌進(jìn)行研究以獲得高效生產(chǎn)菌種及篩選低毒高效抗腫瘤活性的類似物等成為藥物開發(fā)者的新關(guān)注點。前期在定向篩選抗腫瘤活性先導(dǎo)物的過程中，分離獲得產(chǎn)放線菌素D的菌株FIM-N31，鑒定其為銹赤蠟黃鏈霉菌(Streptomyces rubiginosohelvolus)。本研究在初步探索菌株FIMN31生物合成放線菌素D培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，運用微波誘變與抗藥性基因突變組合技術(shù)對該野生菌株FIM-N31進(jìn)行理性篩選，旨在獲得放線菌素D高產(chǎn)菌株，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 菌種

鏈霉菌 Streptomyces rubiginosohelvolus FIMN31由福建省微生物研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基配方

斜面培養(yǎng)基(%，w/V):可溶性淀粉1.0，葡萄糖1.0，硫酸鎂0.05，硝酸鉀0.1，磷酸氫二鉀0.05，瓊脂2.0，pH 7.0～7.2；種子培養(yǎng)基(%，w/V):可溶性淀粉2.5，葡萄糖0.5，黃豆粉1.0，蛋白胨0.5，酵母膏0.3，pH 7.0～7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基(%，w/V):可溶性淀粉2.5，黃豆粉3.5，蛋白胨0.5，玉米粉1.0，磷酸氫二鉀0.05，pH 7.0～7.2。

1.3 方法

1.3.1 原始菌懸液的制備 取4℃保存的原始菌FIM-N31試管斜面生長物適量，劃線接種在斜面培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)8 d后，刮取生長良好的菌苔，置于裝有適量無菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中振蕩，制備均勻的菌懸液。

1.3.2 鏈霉素最低抑菌濃度的測定 分別取上述菌懸液100μL均勻涂布在不同濃度(5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL)鏈霉素的分離平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)并觀察菌落的生長情況。將沒有菌落形成的鏈霉素最低濃度即抗生素對出發(fā)菌株的孢子致死濃度確定為鏈霉素的最低抑菌濃度(MIC)。

1.3.3 原始菌懸液的微波誘變 在無菌條件下，取原始菌懸液6 mL裝入預(yù)先滅菌的15 mL試管中并加防菌硅膠透氣塞，以冰浴法消除微波的熱效應(yīng)，將試管插入盛有適量冰水(作為冷卻劑)的三角瓶里，使菌懸液的上液面沒入冰水中，將三角瓶移置微波爐中，對菌懸液進(jìn)行不同時間(15 s、30 s、45 s、60 s、90 s和120 s)的微波輻照處理。

1.3.4 鏈霉素抗性篩選 取經(jīng)微波誘變處理后的菌懸液適當(dāng)稀釋后各100μL，分別均勻涂布在含有MIC濃度鏈霉素的分離培養(yǎng)基平板上，于30℃培養(yǎng)8 d，在平板上生長出的菌落均為鏈霉素抗性基因(sir)突變株。挑取單菌落劃線接種于平板斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并保存于4℃冰箱中。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)與樣品處理 將突變株分別接種于裝有50mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃、250 r/min搖床發(fā)酵5 d，取發(fā)酵液適量，加入2倍于發(fā)酵液體積的無水乙醇，充分振蕩、靜置、離心，取上清液過濾后進(jìn)行HPLC檢測。

1.3.6 含量(效價)測定 采用HPLC法，分離條件:Gemini C18(4.6 mm×250 mm，5μm)色譜柱，波長254 nm，以甲醇∶水＝78∶22(V/V)為流動相，流速 1.0 mL/min，柱溫:35℃。以放線菌素 D (Sigma公司)為對照品，根據(jù)公式(1)計算效價，發(fā)酵效價為3次平均值，以相對值標(biāo)示。

1.4 主要設(shè)備

WD800型微波爐(Galanz公司)；1360B型超凈工作臺(北京亞泰科隆公司)；MIR-253型微生物培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；ZHWY-2102大型恒溫?fù)u床(上海智城分析儀器制造有限公司)；Allegra X-15R型離心機(jī)(德國BECKMAN公司)；LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)。

2 結(jié)果與分析

2.1 M IC值測定

經(jīng)多次平行實驗，鏈霉素對鏈霉菌FIM-N31菌株孢子的致死濃度測定結(jié)果見表1，表明鏈霉素對鏈霉菌 FIM-N31菌株孢子的 MIC值為50μg/mL，以此為致死抗藥性突變標(biāo)志。

表1 鏈霉素對FIM-N31菌株孢子致死濃度測定Table 1 Lethal concentration determination of streptomycin on FIM-N31 spore.

2.2 微波誘變效應(yīng)

取微波輻照前后FIM-N31的菌懸液適當(dāng)稀釋后各100μL，分別均勻涂布在平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)8 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IM-N31在處理前生長良好，菌落生長數(shù)量隨著微波輻照時間的增長呈減少趨勢，經(jīng)微波輻照90 s以上生長受到明顯抑制，平板上只有少數(shù)的菌落生長，易于單菌落挑選，如圖1(彩圖見圖版二)所示。

2.3 鏈霉素抗性基因突變株篩選

在15～120 s范圍內(nèi)的不同時間微波輻照后進(jìn)行鏈霉素抗性基因突變株的篩選試驗，其微波輻照時間與篩選獲取抗性突變株數(shù)目之間的關(guān)系曲線如圖2所示，結(jié)果表明獲取的抗性突變株數(shù)目隨微波輻照時間的增多而呈現(xiàn)先增后減的分布趨勢，誘變效應(yīng)存在一個最佳區(qū)域，微波輻照時間為60 s時誘變效果最佳，獲得突變株數(shù)達(dá)高峰，因此初步認(rèn)為篩選獲得FIM-N31鏈霉素抗性基因突變株的最佳微波輻照誘變時間應(yīng)為60 s。

圖1 FIM-N31菌株微波處理前后生長菌落比較Fig.1 Growth comparison of FIM-N31 strain before and aftermicrowave treatment.

圖2 微波輻照時間與篩選獲得突變株之間的關(guān)系曲線Fig.2 Relation curve between microwave irradiation and mutants obtained.

經(jīng)微波誘變結(jié)合鏈霉素抗性篩選，獲得鏈霉素抗性基因突變株共計213株。對所得菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵初篩，通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)及發(fā)酵樣品的處理，采用HPLC檢測其放線菌素D含量。以誘變出發(fā)菌株的發(fā)酵效價為100，計算突變株的發(fā)酵相對效價，初篩結(jié)果71株為正突變菌株(相對效價在110以上)，50株為未突變菌株(相對效價在90～110)，92株為負(fù)突變菌株(相對效價在90以下)，如表2所示。

取初篩入選菌株進(jìn)行二級搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，在反復(fù)的篩選中，5株微波誘變突變株發(fā)酵水平較出發(fā)株FIM-N31提高50%以上，顯示出較好的產(chǎn)放線菌素D能力，分別為Str059、Str152、Str178、 Str186和Str195，其中突變株Str186產(chǎn)放線菌素D較出發(fā)株FIM-N31提高8倍(表3)。圖3為突變株Str186發(fā)酵液與FIM-N31發(fā)酵液的HPLC圖譜，表明突變株Str186發(fā)酵液的目標(biāo)產(chǎn)物放線菌素D含量大幅度提高，而小組分放線菌素S含量僅為出發(fā)菌株的2倍多，初步提示所獲得的突變株Str186更利于制備高純度放線菌素D，即更利于放線菌素D分離純化的開展。

表2 抗鏈霉素突變株初篩結(jié)果Table 2 The preliminary results of streptomycin-resistant mutants.

表3 抗性突變高產(chǎn)菌株的搖瓶發(fā)酵情況Table 3 Fermentation of the high-producing streptomycin-resistant mutants.

2.4 Str 186菌株穩(wěn)定性考察

將菌株Str186接種于斜面培養(yǎng)基上，待生長好后置于4℃保藏，考察保藏不同時間的菌株Str186發(fā)酵水平，結(jié)果(表4)表明菌種斜面在4℃保藏3個月效價穩(wěn)定；同時對菌株Str186連續(xù)傳代培養(yǎng)考察菌種的傳代穩(wěn)定性，檢測其生物合成能力，以4℃保存7 d生長良好的第一代菌株為對照，結(jié)果見表5，表明菌株Str186傳5代對發(fā)酵水平無明顯影響，提示菌株Str 186遺傳穩(wěn)定性較好。

圖3 HPLC圖譜比較Fig.3 Comparison of HPLC spectra.

表4 Str186菌株保藏時間穩(wěn)定性試驗Table 4 The stability test of preservation times for Str186.

表5 Str186菌株傳代穩(wěn)定性試驗Table 5 The test of passage stability for Str186.

3 討論

放線菌素D的研究目前主要集中于放線菌素D的生物學(xué)功能和臨床藥理學(xué)，并己廣泛用于惡性腫瘤的臨床治療，但對微生物發(fā)酵和分離純化方面的研究報道較少，目前國內(nèi)放線菌素D生產(chǎn)中存在菌種發(fā)酵水平低、產(chǎn)率低、單耗高的缺陷，菌種選育已成為提高放線菌素D產(chǎn)量和質(zhì)量的重要課題。廖愛芳等[8]采用紫外線誘變結(jié)合纈氨酸耐性變種的篩選，得到產(chǎn)量提高2倍的放線菌素D突變株，本研究應(yīng)用分子育種中關(guān)于抗生素產(chǎn)生菌抗性基因與抗生素合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因連鎖而易發(fā)生共突變理論，首次將微波誘變結(jié)合抗生素抗性篩選方法應(yīng)用于放線菌素D的選育，獲得良好的效果。在微波誘變試驗中采用低溫?zé)岱稚⒎ㄏ⒉ǖ臒嵝?yīng)，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，微波輻照45 s后作為冷卻劑的冰水仍有部分冰未完全融解，受試菌懸液的溫度也并未升高。因此，在微波輻照實際操作中，每輻照45 s即更換冰水，盡可能消除微波熱效應(yīng)對受試菌的影響，同時凸顯出非熱效應(yīng)對受試菌的誘變作用。鏈霉素抗性篩選具有廣譜性、正突變率和增產(chǎn)百分率高等特點，以鏈霉素抗性作為選擇壓力，對許多抗生素產(chǎn)生菌進(jìn)行推理選育所得到的突變株中都能獲得較高頻率的高效價突變株[9～13]。

本試驗中通過組合運用微波誘變與鏈霉素抗性突變篩選技術(shù)，改造了Streptomyces rubiginosohelvolus FIM-N31菌株的代謝功能，篩選所獲取的抗性突變株數(shù)目較多，隨之篩選較好的活性突變株的幾率亦提高，有利于高效獲得遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良高活性突變株，其中突變菌株Str186遺傳性狀穩(wěn)定，產(chǎn)放線菌素D能力強(qiáng)，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

影響菌種的菌體生長和產(chǎn)素能力的因素很多，如發(fā)酵培養(yǎng)基成分與初始pH、生長因子與前體物、溶氧、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等影響因子，某種代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)或抑制、菌體生長形態(tài)與目標(biāo)產(chǎn)物合成之間的關(guān)系，優(yōu)良菌種在最適宜發(fā)酵條件下才能充分發(fā)揮菌株的遺傳潛力，因此突變菌株Str186生物合成放線菌素D的調(diào)控過程的優(yōu)化也有待深入探究。

[1] 李長春，潘毅生，黃培根，等.放線菌素23-21的抗癌藥理研究[J].福建醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1992，26(1):9.

[2] 林菁，李常春，黃自強(qiáng).放線菌素23-21對敏感腫瘤細(xì)胞生物大分子的影響[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1997，31(3): 247-251.

[3] 孫肇暘，楊秀萍.放線菌素研究進(jìn)展[J].首都師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2011，32(1):54-58.

[4] 洪靜娟.5-氟尿嘧啶聯(lián)合更生霉素治療惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤療效評價[J].海南醫(yī)學(xué)，2004，15(1):99-100.

[5] 梁平，李濟(jì)培，王洪乾.新福菌素配合放射治療鼻咽癌近期療效觀察[J].右江醫(yī)學(xué)，2005，33(5):476-477.

[6] 侯森，侯君，朱志真，等.新福菌素注射液治療惡性胸腔積液臨床觀察[J].四川腫瘤防治，2006，19(3):203-204.

[7] 李述文，鄭亞平，高怡生.放線菌素類似物的合成Ⅳ—2-氨基-4，6-二甲基吩嗯嗪酮-(3)-1，9-雙多肽的合成[J].藥學(xué)學(xué)報，1982(5):20-25.

[8] 廖愛芳，劉勇，王建民，等.放線菌素D產(chǎn)生菌淺藤黃鏈霉菌N45誘變育種研究[J].藥物生物技術(shù)，2002，9(2):88 -90.

[9] 涂國全，鐘承贊，黃 林，等.通過獲得鏈霉素抗性基因突變株篩選小諾霉素高產(chǎn)菌株[J].微生物學(xué)通報，2004，31 (4):19-22.

[10] 陶純長，諶頡，郭美錦，等.鏈霉素抗性突變理性篩選avermectin高產(chǎn)菌株[J].中國抗生素雜志，2002，27(9):521-523，528.

[11] 孫玉雯，崔承彬.抗生素抗性篩選在微生物菌株選育中的作用[J].國際藥學(xué)研究雜志，2008，35(3):213-217.

[12] Hosoya Y，Okamoto S，Muramatau H，et al..Acquisition of certain streptomycin-resistant(str)mutations enhances antibiotic production in bacteria[J].Antimicrob.Agents.Chemother，1998，42(8):2041-2047.

[13] 劉體顏，邢玉華，戴素琴，等.達(dá)托霉素生產(chǎn)菌(ATCC31568)的紫外誘變和抗生素抗性篩選[J].中國抗生素雜志，2013，38(9):664-669.

Screening of Actinomycin D High-producing Strain by Streptomycin Resistant Mutant Selection Coupled with Microwave Mutagenesis

REN Lin-ying，ZHANG Zhu-lan?，WANG De-sen，YANG Huang-jian，TANGWen-li，SUN Fei
Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products，F(xiàn)ujian Institute of Microbiology，F(xiàn)uzhou 350007，China

Microwave mutagenesis and streptomycin resistance screening was applied to screen actinomycin D high-producting strain.After testing the resistance of Streptomyce rubiginosohelvolus FIM-N31 to streptomycin，the lethal concentration of streptomycin was determined.A lot of streptomycin-resistant mutants were screened after the spores regenerated on the lethal streptomycin concentration(50μg/mL)media when they were treated with microwave irradiation.Itwas eventually found that the high-yield strain Str186 from these mutants which was stably inheritable，and the productivity was beyond eight times higher than the original strains in the rotation-flask experiments.

Streptomyces；actinomycin D；antibiotics resistance gene screening；compound mutation

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.05.09

2015-05-08；接受日期:2015-06-15

福建省科技項目(2014R1009-10)資助。

任林英，高級工程師，研究方向為微生物藥物。E-mail:rlymary＠aliyun.com。?通信作者:張祝蘭，研究員，研究方向為微生物藥物。E-mail:jessylan9963＠sina.com