郭倩楠， 周正富， 徐玉泉， 張 維

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

食線蟲真菌圓錐掘氏梅里霉的高效培養(yǎng)基研究

郭倩楠， 周正富， 徐玉泉， 張 維?

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

作為一種內(nèi)寄生食線蟲真菌，圓錐掘氏梅里霉(Drechmeria coniospora)在常規(guī)真菌培養(yǎng)基(如PDA、SDAY和CMA)中生長周期較長(最短為13 d)，不利于對其進(jìn)行科學(xué)研究。應(yīng)用LK-100固體培養(yǎng)基常溫培養(yǎng)D.coniospora，通過顯微鏡觀察其生長狀態(tài)，確定生長周期。研究表明，D.coniospora在LK-100培養(yǎng)基中的生長周期僅8 d，遠(yuǎn)短于在常規(guī)培養(yǎng)基上的生長周期。此外，與常規(guī)培養(yǎng)基相比，該培養(yǎng)基獲得的D.coniospora分生孢子具有更強(qiáng)的侵染宿主秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)的能力。LK-100培養(yǎng)基為進(jìn)行D.coniospora相關(guān)研究提供了快速、高效的培養(yǎng)方法。

圓錐掘氏梅里霉；LK培養(yǎng)基；生長周期；侵染能力

全球每年由植物寄生線蟲造成的作物經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1 570億美元[1]，開發(fā)高效的殺線蟲制劑成為全人類面臨的重要挑戰(zhàn)。因此，研究高效專一、環(huán)境效益好、成本低的生物防治線蟲制劑成為科學(xué)家的共同目標(biāo)[2，3]。食線蟲真菌(nematophagous fungi)能夠以一定方式(寄生、捕捉、定殖或毒殺)侵染線蟲[4]，是防治線蟲病害的有效途徑。

圓錐掘氏梅里霉(Drechmeria coniospora)，是一種專性內(nèi)寄生食線蟲真菌，最早由Drechsler[5]于1941年分離發(fā)現(xiàn)。該菌可有效防治多種線蟲，包括植物病原線蟲(如草莓芽葉線蟲Aphelenchoides fragariae、馬鈴薯腐爛線蟲Ditylenchusdestructor和南方根結(jié)線蟲 Meloidogyne incognita[6～8])和食細(xì)菌線蟲(全齒復(fù)活線蟲Panagrellus redivivus[9]和秀麗隱桿線蟲 Caenorhabditis elegans[10])等。掃描電子顯微鏡觀察顯示，D.coniospora通過分生孢子特異地侵染C.elegans，侵染過程主要為識別、附著、侵入、萌發(fā)和產(chǎn)孢[11]。作為內(nèi)寄生食線蟲真菌的典型代表，D.coniospora常被科學(xué)家用于研究食線蟲真菌與線蟲的識別機(jī)制[12～19]。

1942年，Glaser等[20]首次使用由牛肝臟和腎臟制成的培養(yǎng)基(牛肝臟或腎臟濃度為200 g/L)培養(yǎng)線蟲(Neoaplectana glascri)和 Neoaplectana chresimn，培養(yǎng)23 d時(shí)，線蟲達(dá)到穩(wěn)定期。1966年，Poinar和Thomas[21]應(yīng)用濃度均為100 g/L的牛肝臟和腎臟組織為培養(yǎng)基，培養(yǎng)新無小紋蟲屬線蟲(Neoaplectana sp.)。此后，該種培養(yǎng)基陸續(xù)被用于小卷蛾斯氏線蟲(Steinernema carpocapsae)及其他斯氏線蟲(Steinernema)等的培養(yǎng)及相關(guān)研究，被培養(yǎng)的線蟲由卵發(fā)育為成蟲約21 d[22～24]。但是，迄今為止，并未見利用LK培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌的相關(guān)報(bào)道。

作為典型的內(nèi)寄生食線蟲真菌，D.coniospora在常規(guī)真菌培養(yǎng)基(包括PDA、SDAY和CMA)上培養(yǎng)周期較長(培養(yǎng)周期最短的為SDAY，13 d)，一定程度上影響了對D.coniospora的實(shí)驗(yàn)研究。因此，尋找一種高效培養(yǎng)D.coniospora的培養(yǎng)基顯得尤為重要。本研究利用LK-100固體培養(yǎng)基在室溫條件下成功培養(yǎng)D.coniospora，較常規(guī)真菌培養(yǎng)基顯著縮短了培養(yǎng)周期，有效避免了長時(shí)間培養(yǎng)易造成的染菌現(xiàn)象。并且，培養(yǎng)所得D.coniospora分生孢子侵染天然宿主C.elegans能力增強(qiáng)。LK培養(yǎng)基在真菌培養(yǎng)中的應(yīng)用，為食線蟲真菌的深入研究提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株

Drechmeria coniospora ARSEF 6962由美國農(nóng)業(yè)部提供；Caenorhabditis elegans N2和Escherichia coli OP50由中國科學(xué)院生物物理研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LK培養(yǎng)基:稱取若干質(zhì)量豬肝和豬腎，切成小塊，放入勻漿機(jī)打碎。在上述所得組織勻漿中分別加入5 g NaCl和15 g瓊脂，蒸餾水定容至1 L。1×105Pa滅菌30 min。其中，試驗(yàn)所用不同肝腎組成的LK培養(yǎng)基成分見表1。

表1 不同肝腎組成的LK培養(yǎng)基成分Table 1 Composition of different LK medium.

SDAY(dextrose neopeptone yeast extract agar)培養(yǎng)基:細(xì)菌蛋白胨(BD公司)10 g/L，酵母提取物(OXOID公司)10 g/L，葡萄糖(西隴化工有限公司)40 g/L，瓊脂 15 g/L；PDA(potato dextrose agar)培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；CMA(corn meal agar)培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；培養(yǎng)條件為常溫培養(yǎng)。

1.3 D.coniospora培養(yǎng)方法

吸取 200μL濃度為 1×108/mL的 D. coniospora孢子懸浮液，涂布固體培養(yǎng)基平板，封口膜封口，倒置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 D.coniospora生長狀態(tài)鑒定

用無菌接種環(huán)挑取微量菌體，均勻涂布于載玻片上，蓋上蓋玻片，即為樣本。通過光學(xué)顯微鏡觀察樣本，確定菌株的生長狀態(tài)，記錄不同生長階段所用的培養(yǎng)時(shí)間。

1.5 D.coniospora侵染線蟲(C.elegans)效率實(shí)驗(yàn)

收集培養(yǎng)基上的D.coniospora分生孢子，將分生孢子重懸于0.85%的生理鹽水中，使終濃度為1×108/mL，孢子重懸液涂布水-瓊脂培養(yǎng)基。篩選100～200條處于L3～L4期的C.elegans，加到含有D.coniospora分生孢子的水-瓊脂培養(yǎng)基上。25℃孵育，分別共培養(yǎng)1～10 d取樣(取樣間隔為1 d)。光學(xué)顯微鏡觀察侵染情況，記錄被侵染線蟲數(shù)量，計(jì)算侵染效率[6，25]。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，繪制侵染效率曲線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 D.coniospora的生長周期

D.coniospora在培養(yǎng)基中的生長周期主要分為3個(gè)階段(圖1，彩圖見圖版二)。階段1:菌絲體時(shí)期，菌體以絲狀菌絲體形態(tài)存在(圖1A)；階段2:產(chǎn)孢子時(shí)期，菌絲體上產(chǎn)生分生孢子梗，在孢子梗頂端或旁側(cè)的產(chǎn)孢細(xì)胞產(chǎn)生瓶梗，瓶梗頂端產(chǎn)孢墊上產(chǎn)生淚滴狀分生孢子(圖1B)；階段3:孢子成熟期，分生孢子從分生孢子梗上脫落，并在其頂端長出微小的芽體，形成成熟的淚滴狀分生孢子(圖1C)。形成的新一代分生孢子會休眠，直到處于合適的環(huán)境中，才會重新萌發(fā)。2.2 LK培養(yǎng)基中肝和腎含量分別對D.coniospora生長的影響

圖1 D.coniospora在培養(yǎng)基中的生長周期Fig.1 The growth cycle of D.coniospora in medium.

為了探究LK培養(yǎng)基中肝、腎添加量對D.coniospora生長周期的影響，試驗(yàn)觀察了 D. coniospora分生孢子在 LK-0-0、L-100、K-100和LK-100培養(yǎng)基中的生長周期，結(jié)果如圖2所示。

圖2 D.coniospora在不同LK培養(yǎng)基中的生長周期Fig.2 Growth cycle of D.coniospora in different LK medium.

D.coniospora在L-100、K-100和LK-100培養(yǎng)基上的生長周期分別為12 d、10 d和8 d，表明腎臟組織對D.coniospora菌株生長的促進(jìn)作用優(yōu)于肝臟組織。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，D.coniospora在K-100和LK-100培養(yǎng)基中的階段1所用培養(yǎng)時(shí)間(平均值)相同，說明培養(yǎng)基中腎臟組織或其某種成分能夠促進(jìn)D.coniospora菌絲的萌發(fā)。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D.coniospora分生孢子在LK-0-0培養(yǎng)基(陰性對照培養(yǎng)基)中雖然能夠萌發(fā)形成菌絲，但是生長周期長達(dá)55 d。其中，從接種D. coniospora孢子液到萌發(fā)形成菌絲(階段1)需要15 d，而從菌絲進(jìn)一步形成成熟的分生孢子(階段2和階段3)需要40 d。

綜上，雖然LK-0-0培養(yǎng)基能使D.coniospora孢子萌發(fā)并產(chǎn)孢(初步推測D.coniospora能夠分泌瓊脂酶)，但是瓊脂作為LK-0-0培養(yǎng)基中的唯一碳源，并不能提供良好的營養(yǎng)條件。因此，LK-100培養(yǎng)基中的肝臟和腎臟組織對D.coniospora的生長和發(fā)育有顯著的促進(jìn)作用。

2.3 不同培養(yǎng)基中D.coniospora的生長周期

D.coniospora在常規(guī)真菌培養(yǎng)基(PDA、SDAY和CMA)及LK-100培養(yǎng)基中的生長周期顯著不同，結(jié)果如圖3所示。

圖3 D.coniospora在不同真菌培養(yǎng)基中的生長周期Fig.3 The growth cycle of D.coniospora in different fungimedium.

由圖2可知，D.coniospora在CMA、PDA和SDAY等常規(guī)真菌培養(yǎng)基中的生長周期分別為27 d、16 d和13 d，而在LK-100培養(yǎng)基中的生長周期大大縮短，僅需8 d。另外，D.coniospora在LK-100培養(yǎng)基中的生長周期與侵染宿主 C. elegans的周期[11]相同，均為8 d。

2.4 不同培養(yǎng)基的D.coniospora分生孢子侵染線蟲能力的研究

觀察LK-100、PDA、SDAY和CMA等不同培養(yǎng)基獲得的D.coniospora分生孢子在一定時(shí)間侵染的線蟲數(shù)，繪制侵染效率曲線圖(圖4)。

圖4 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的D.coniospora侵染線蟲效率曲線圖Fig.4 Infection efficiency graph of D.coniospora in differentmedium

從LK-100培養(yǎng)基上收集的D.coniospora分生孢子在與線蟲共培養(yǎng)4 d時(shí)，完成對所有線蟲的侵染，即侵染率達(dá)到100%；從SDAY培養(yǎng)基收集的D.coniospora分生孢子完成對所有線蟲的侵染約需要5 d；PDA和CMA培養(yǎng)基則需要6 d。以上侵染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LK-100培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的D.coniospora分生孢子侵染線蟲能力略高于其他培養(yǎng)基，這可能與LK培養(yǎng)基縮短了D.coniospora的生長周期有關(guān)，而D.coniospora在其他培養(yǎng)基上生長周期較長，一定程度上影響了其復(fù)蘇過程及侵染活力。

3 討論

本研究針對D.coniospora在常規(guī)真菌培養(yǎng)基上生長周期長，影響對D.coniospora進(jìn)行相關(guān)深入研究這一難題，研究應(yīng)用LK固體培養(yǎng)基高效培養(yǎng)D.coniospora。本研究也是首次成功將LK-100培養(yǎng)基應(yīng)用于食線蟲真菌乃至真菌的培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)表明，D.coniospora在LK-100培養(yǎng)基中生長周期僅為8 d，產(chǎn)孢期集中，培養(yǎng)獲得的分生孢子侵染天然宿主C.elegans的能力較常規(guī)培養(yǎng)基獲得的分生孢子有所增強(qiáng)。

LK-100固體培養(yǎng)基使D.coniospora生長周期縮短的原因可能是:D.coniospora為專性內(nèi)寄生食線蟲真菌，特異地侵染富含蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的天然宿主線蟲。因此，由富含蛋白質(zhì)的肝臟和腎臟組織制成的LK-100培養(yǎng)基模擬了線蟲的營養(yǎng)組成，使得D.coniospora的生長周期與侵染其天然宿主的周期相同，均為8 d。而常規(guī)真菌培養(yǎng)基成分則不能較好的滿足D.coniospora的生長需要，培養(yǎng)周期長達(dá)13 d。而且，LK-100固體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的D.coniospora分生孢子的侵染能力較PDA、CMA和SDAY等常規(guī)培養(yǎng)基稍有增強(qiáng)，這一現(xiàn)象可能與LK培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成與線蟲類似有關(guān)。此外，據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，腎臟在D.coniospora生長周期的菌絲體期發(fā)揮重要作用，但是，肝臟和腎臟對D.coniospora生長發(fā)育的具體促進(jìn)因子及作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

LK-100培養(yǎng)基使 D.coniospora的培養(yǎng)周期縮短為8 d，解決了D.coniospora培養(yǎng)周期長這一技術(shù)難題，為進(jìn)一步研究和闡明D.coniospora侵染C.elegans的機(jī)制，加快內(nèi)寄生食線蟲真菌在生物防治中的應(yīng)用等提供理論和技術(shù)支撐。

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Study on an Efficient Medium to Culture the Nematophagous Fungus Drechmeria coniospora

GUO Qian-nan，ZHOU Zheng-fu，XU Yu-quan，ZHANGWei?
Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China

There is an obstacle to doing scientific research on nematophagous fungus Drechmeria coniospora，owing to the shortest growth cycle of the microbe in conventional medium(including PDA，SDAY and CMA)is 13 days at least.In this study，we utilized LK-100 medium to culture D.coniospora at room temperature，and observed its growth status under microscope.The results showed that growth cycle of D.coniospora on LK-100 medium was only 8 days.Furthermore，the infection efficiency of conidia，obtained from LK-100 medium，to natural host Caenorhabditis elegans was higher than that obtained from conventional fungimedia.LK-100 medium，a kind of effectivemedium，will contribute to the further study of D.coniospora.

Drechmeria coniospora；LK medium；growth cycle；infection ability

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.05.10

2015-05-18；接受日期:2015-06-16

國家973計(jì)劃項(xiàng)目(2015CB755703)；國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX0800301B)資助。

郭倩楠，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物基因工程研究。E-mail:guoqiannan0709＠163.com。?通信作者:張 維，研究員，主要從事環(huán)境微生物分子生物學(xué)研究。E-mail:zhangwei01＠caas.cn