曾奇玉， 梁麗妮， 楊永鳳， 朱美娟， 蘇 平

湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃石435000

一株重金屬高耐受菌的分離及鑒定

曾奇玉， 梁麗妮， 楊永鳳， 朱美娟， 蘇 平?

湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃石435000

利用含不同濃度的重金屬選擇性培養(yǎng)基，對(duì)采集的微生物樣本進(jìn)行分離，并篩選出一株超高耐受重金屬菌ZM-12。對(duì)ZM-12的16S rDNA高變區(qū)序列進(jìn)行BLAST比較和MEGA 4.0分析，結(jié)果通過(guò)同源進(jìn)化樹(shù)分析表明該菌屬于腸桿菌屬(Enterobacter)。對(duì)該菌進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)、最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定和火焰原子吸收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明:ZM-12屬于革蘭氏陰性桿菌，在不同種類(lèi)的重金屬培養(yǎng)基中，其MIC值各不相同，Cu2＋、Pb2＋、Mn2＋、Ni2＋對(duì)ZM-12的MIC值分別為22.33 mmol/L、14.48mmol/L、＞200 mmol/L、58.69mmol/L。通過(guò)火焰原子吸收的方法，測(cè)定了ZM-12對(duì)培養(yǎng)基中重金屬的去除率，培養(yǎng)一定時(shí)間后，分別測(cè)定了溶液中重金屬 Pb2＋、Mn2＋、Cu2＋、Ni2＋的濃度，得到其最大去除率分別達(dá)到97.68%、99.93%、41.23%、99.46%。該菌株的發(fā)現(xiàn)及鑒定為重金屬污染環(huán)境的治理提供了參考。

重金屬耐受菌；腸桿菌屬；16S rDNA；最低抑菌濃度(MIC)；去除率

重金屬污染來(lái)源廣泛，主要包括礦冶、化工和機(jī)械制造等。由于重金屬在環(huán)境中不能被降解，它會(huì)參與食物鏈循環(huán)并最終在生物體內(nèi)積累，其對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康的危害極大。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)可以利用某些微生物將重金屬吸附或者通過(guò)微生物的作用將毒性?xún)r(jià)態(tài)的重金屬轉(zhuǎn)化成低毒性或無(wú)毒性?xún)r(jià)態(tài)[1]。通過(guò)人工篩選鑒定，這些微生物具有很強(qiáng)的適應(yīng)力，能在pH和溫度條件范圍相對(duì)較寬的環(huán)境中正常生長(zhǎng)，同時(shí)利用微生物去除重金屬還有投資少、運(yùn)行費(fèi)用低、處理效率高、無(wú)二次污染等特點(diǎn)[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)人為導(dǎo)致的重金屬富集量較大的環(huán)境進(jìn)行采樣，從中篩選出一株超耐受重金屬菌株 ZM-12，利用細(xì)菌16S rDNA分子鑒定法對(duì)ZM-12進(jìn)行了種屬鑒定，并在重金屬環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，得到ZM-12耐受重金屬Pb2＋、Mn2＋、Cu2＋、Ni2＋的MIC值，并利用火焰原子吸收實(shí)驗(yàn)考察了ZM-12對(duì)不同種類(lèi)重金屬離子的去除能力，以期為重金屬污染環(huán)境的修復(fù)提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；T4 DNA Ligase為NEB公司產(chǎn)品；Taq酶和dNTP均為Pointbio公司產(chǎn)品；上、下游通用引物27F和1502F購(gòu)自北京天一輝遠(yuǎn)公司。菌種ZM-12由采樣分離所得。

重金屬培養(yǎng)基[3]:準(zhǔn)確配制含 Pb2＋、Mn2＋、Cu2＋、Ni2＋1 mol/L的重金屬溶液，在超凈工作臺(tái)中將重金屬溶液添加至LB培養(yǎng)基中，配制成Pb2＋(4.82～14.48 mmol/L)、Mn2＋(18.5～200 mmol/L)、Cu2＋(6.25～22.33 mmol/L)、Ni2＋(5.11～58.69 mmol/L)梯度濃度的重金屬培養(yǎng)液。

1.2 菌體采集

湖北黃石是一個(gè)礦冶歷史悠久的城市，菌體采集主要考慮人為導(dǎo)致的重金屬富集量較大的地點(diǎn)，土壤樣品采自來(lái)源不同的3個(gè)地方:①黃石市湖北師范學(xué)院后山采礦廢水湖；②湖北師范學(xué)院化工化學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)廢液池(有機(jī)池、無(wú)機(jī)池)；③碼頭礦堆廢水。

1.3 菌體分離純化

取采集的土壤樣品，裝入聚乙烯塑料容器，按固液比1∶10(g/mL)的比例加入無(wú)菌蒸餾水，30℃恒溫震蕩箱(150 r/min)培養(yǎng)30 min，取上清液1 mL于裝有9 mL滅菌水的試管中，此為10-1濃度，再依次稀釋成 10-2、10-3、10-4濃度梯度[4，5]。取10-3、10-4稀釋液 0.1 mL涂布于含有3.1 mmol/L Cu2＋的固體培養(yǎng)基上，將平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后挑取平板上的單菌落在3.1 mmol/L Cu2＋的固體培養(yǎng)基上劃線，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，多次劃線分離純化細(xì)菌。

1.4 最低抑菌濃度(M IC)測(cè)定

將分離的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)(37℃，160 r/min，培養(yǎng)12 h)。將配制好的重金屬培養(yǎng)基分裝于試管中，再在每支試管中加入 100 mL菌液進(jìn)行梯度培養(yǎng)(160 r/min，37℃)。培養(yǎng)48 h后，取5 mL菌液滴加到重金屬固體培養(yǎng)基中涂布培養(yǎng)，觀察是否長(zhǎng)出菌落，以此驗(yàn)證最大MIC值[4]。

1.5 重金屬離子去除率的測(cè)定

利用火焰原子吸收光譜儀測(cè)定重金屬的離子去除率。根據(jù)儀器的可測(cè)范圍(0.2～10 mg/L)，利用1%的稀硝酸溶液配制4種重金屬離子的一定濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度配制100 mL于容量瓶中定容。配制樣液，在一定濃度重金屬培養(yǎng)基(Pb2＋14.5 mmol/L、Mn2＋109.2 mmol/L、Cu2＋18.8mmol/L、Ni2＋15.3 mmol/L)中培養(yǎng)ZM-12，72 h后取培養(yǎng)液于離心管中，離心取上清，將上清液配制成可測(cè)范圍內(nèi)的濃度的樣液。最后，通過(guò)混合標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定樣液中4種重金屬離子的濃度，即可得到ZM-12在培養(yǎng)過(guò)程中重金屬的去除率[6]。

1.6 菌屬鑒定

以細(xì)菌菌液作為PCR擴(kuò)增模板，引物為細(xì)菌16S rDNA PCR通用引物:27F-5′-CGGCTACCTTGTTACGACT-3′，1502F-5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′[4]。

利用PCR擴(kuò)增技術(shù)提取及擴(kuò)增DNA，并采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。利用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA回收，連接至載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)DH5α細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR檢測(cè)確認(rèn)后，由北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測(cè)序，序列結(jié)果通過(guò)BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)分析[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與生理生化特性

利用0.2 g/L Cu2＋重金屬培養(yǎng)基進(jìn)行初次培養(yǎng)篩選(160 r/min，37℃，12 h)，得到7株大小形態(tài)不同的菌株，再利用0.2～1 g/L Cu2＋梯度濃度的重金屬培養(yǎng)基對(duì)這7種菌株進(jìn)行篩選(160 r/min，37℃，12 h)，結(jié)果只有一株菌株能夠在1 g/L的Cu2＋重金屬培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，將其命名為ZM-12，并經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)其最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適pH為7.2，ZM-12的最適生長(zhǎng)溫度和pH如圖1所示。

圖1 ZM-12最適生長(zhǎng)溫度(A)和pH(B)Fig.1 The optimum growth temperature(A)and pH(B)of ZM-12.

根據(jù)革蘭氏染色(圖2，彩圖見(jiàn)圖版二)觀察到ZM-12為革蘭氏陰性腸桿菌，并通過(guò)淀粉酶水解實(shí)驗(yàn)可知ZM-12能夠分泌淀粉水解酶水解淀粉，最后在過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)中證實(shí)ZM-12能夠釋放過(guò)氧化氫酶，使過(guò)氧化氫水解[7]。

圖2 ZM-12的菌體形態(tài)(×1 000)Fig.2 Morphology of ZM-12 strain(×1 000).

2.2 ZM-12 16S rDNA分析

以菌ZM-12總DNA為模板，利用方法1.6得到ZM-12的16S rDNA，與載體pMD18-T過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選挑取單克隆，并提取得到該單克隆質(zhì)粒，然后對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)。將ZM-12的16S rDNA的PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒和質(zhì)粒PCR檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[8，9]，可知細(xì)菌ZM-12的16S rDNA在1 500 bp左右(圖3)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶大小和質(zhì)粒的PCR檢測(cè)結(jié)果都在1 500 bp左右，這表明該擴(kuò)增產(chǎn)物是目的DNA片段[4]。

ZM-12菌的16S rDNA測(cè)序結(jié)果，利用NCBI BLAST比對(duì)ZM-12菌的16S rDNA測(cè)序結(jié)果，并在MEGA 4.0軟件中構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，對(duì)所測(cè)定的ZM-12及與它同源性最高的 10株細(xì)菌的16S rDNA全序列進(jìn)行遺傳距離計(jì)算，根據(jù)遺傳距離得到系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)[10，11]。

圖3 16S rDNA的電泳圖Fig.3 The electrophoresis of 16S rDNA.

根據(jù)BLAST結(jié)果顯示，ZM-12與腸桿菌屬Enterobacter中的 Enterobacter cloacae及 Enterobacter ludwigii的16S rDNA序列具有99%的高度同源性，該菌株16S rDNA序列在GenBank中的序列注冊(cè)號(hào)為KP984768[7]。由圖4可以看出，ZM-12與腸桿菌屬中的Enterobacter ludwidgii和Enterobacter cloacae進(jìn)化距離近，而與Chryseobacterium進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，因此可以判斷ZM-12屬于腸桿菌屬(Enterobacter)[12]。

2.3 最低抑菌濃度(M IC)

MIC值是指各種重金屬能抑制培養(yǎng)液中細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度，MIC值越大，重金屬對(duì)菌體的毒性越小，相反，其對(duì)菌體的毒性就越大[4]。ZM-12能夠耐受Pb2＋、Mn2＋、Cu2＋、Ni2＋等多種重金屬，利用方法1.4測(cè)定ZM-12對(duì)Cu2＋、Pb2＋、Mn2＋、Ni2＋耐受濃度，如表1所示。

圖4 ZM-12 16S rDNA序列的無(wú)根系統(tǒng)發(fā)育分析樹(shù)Fig.4 The rootless phylogenetic tree of ZM-12 16s rDNA sequence.

表1 ZM-12菌株的最低抑菌濃度(mmol/L)Table 1 The MIC value of ZM-12(mmol/L).

通過(guò)表1數(shù)據(jù)分析，ZM-12的MIC值明顯高于現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)的重金屬耐受菌[4，7]，4種重金屬對(duì)ZM-12毒性大小:Pb2＋(14.48 mmol/L)＞Cu2＋(22.33 mmol/L)＞Ni2＋(58.69 mmol/L)＞Mn2＋(＞200 mmol/L)，即 Pb2＋對(duì) ZM-12的菌體毒性最大[7]。

2.4 重金屬離子去除率

利用方法1.5，將培養(yǎng)72 h后的重金屬培養(yǎng)基取出并離心，配制成樣液，根據(jù)儀器的使用范圍配制濃度梯度標(biāo)液。將配置好的樣液和標(biāo)液進(jìn)行火焰原子吸收測(cè)定，得到的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，得到ZM-12菌株的最大去除率[6]。

表2 ZM-12菌株的最大去除率Table 2 The removal rate of ZM-12.

對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行分析，ZM-12對(duì)這4種金屬離子的去除率大小比較:Mn2＋(99.93%)＞Cu2＋(99.46%)＞Pb2＋(97.68%)＞Ni2＋(41.23%)，即ZM-12對(duì)Mn2＋和Cu2＋的去除率最大。

3 討論

隨著工業(yè)日益發(fā)展，大量重金屬以工業(yè)廢渣、廢水、廢氣形式排入環(huán)境，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年釋放到環(huán)境中的重金屬高達(dá)數(shù)百萬(wàn)噸，并且還在逐年增加，人們對(duì)重金屬環(huán)境污染的認(rèn)識(shí)以及現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，使微生物治理重金屬污染逐漸受到重視。某些微生物對(duì)重金屬的吸收、沉積、氧化和還原等作用可有效減少植物的攝入，從而降低重金屬的毒性。

蘇艷蓉等[4]發(fā)現(xiàn)某種細(xì)菌對(duì)Pb2＋和Mn2＋的耐受濃度分別達(dá)到9.66 mmol/L和27.78 mmol/L。張花香等[13]研究了金礦區(qū)蠟樣芽孢桿菌對(duì)重金屬離子 Cu2＋、Zn2＋、Au3＋、Ag＋的耐受性。黃峰源等[14]發(fā)現(xiàn)嗜酸性氧化硫硫桿菌 TS6對(duì) Cu2＋、Cr3＋、Zn2＋、Ni2＋的濃度分別達(dá)到6.25 mmol/L、28.8 mmol/L、15.29 mmol/L和4.23 mmol/L。Hoyle和Beveridag[15]研究了枯草牙孢桿菌 (Bacillus subtilis)細(xì)胞壁上的肽聚糖，證明其可以從水溶液中絡(luò)合大量的金屬離子。

本實(shí)驗(yàn)從人工導(dǎo)致重金屬富集量較大且富集時(shí)間較長(zhǎng)的樣地進(jìn)行采集，從這類(lèi)樣品中分離的菌種大部分具有重金屬耐受性。但是，ZM-12具有突出的重金屬耐受性，其MIC值和重金屬離子去除率普遍高于現(xiàn)今已報(bào)道的菌株[4，13，14]，重金屬耐受機(jī)制可能與目前研究并報(bào)道的重金屬耐受菌有所不同[15～18]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)ZM-12在培養(yǎng)過(guò)程中可能會(huì)自發(fā)分泌CO，與Mn2＋結(jié)合并反應(yīng)形成MnCO3沉淀，因此諸如Pb2＋、Mn2＋、Ca2＋等金屬離子在培養(yǎng)過(guò)程中能與CO形成大量沉淀，使重金屬離子由可溶性游離態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄猿恋?，以此達(dá)到重金屬離子去除的效果。目前，本課題組正在對(duì)CO的釋放現(xiàn)象進(jìn)行基因水平的研究，從ZM-12生長(zhǎng)發(fā)育狀況和代謝水平上進(jìn)行觀察和驗(yàn)證，從而為環(huán)境中重金屬污染吸附機(jī)制研究提供有益的依據(jù)。

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Isolation and Identification of a Bacterium Tolerant to High Concentration Heavy Metals

ZENG Qi-yu，LIANG Li-ni，YANG Yong-feng，ZHU Mei-juan，SU Ping?
Life Science College，Hubei Normal University，Hubei Huangshi 435000，China

A strain that resist to heavy metals with high concentration，named ZM-12，was isolated by using selective culture medium containing different concentrations of heavymetals.It was identified as Enterobacter according to the BLAST comparison，the analysis in MEGA 4.0 and the phylogenetic tree.ZM-12 was Gram-negative by using the Gram stain test.In different heavy metalmedium，the MIC value is different.It can be tolerant of Cu2＋22.33 mmol/L，Ni2＋58.69 mmol/L，Pb2＋17.84 mmol/L and Mn2＋＞200mmol/L.The removal rate of heavy metals can be obtained by atomic absorption spectroscopy(AAS).The removal rate of Pb2＋，Mn2＋，Cu2＋，Ni2＋were 97.68%，99.93%，41.23%，99.46%，respectively.We can conclude that ZM-12 has high resistance to many different heavy metals.The isolation and identification of this strain can provide some basis for the pollution caused by heavy metals.

strain with heavy metals tolerance；Enterobacter；16S rDNA；minimum inhibitory concentration(MIC)；the removal rate

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.05.11

2015-03-26；接受日期:2015-04-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41171045)；湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究資助項(xiàng)目(D20092201)；湖北師范學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目(2008F16)資助。

曾奇玉，本科生，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail:zqy0512＠qq.com。?通信作者:蘇 平，副教授，主要從事環(huán)境生物學(xué)的研究。E-mail:suping1202＠126.com