周必英，劉美辰，萬小波

(遵義醫(yī)學(xué)院 寄生蟲學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

專家論壇

豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌誘導(dǎo)家豬免疫應(yīng)答

周必英，劉美辰，萬小波

(遵義醫(yī)學(xué)院 寄生蟲學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

目的 觀察豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌口服灌胃和肌肉注射家豬后誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。方法 12頭40日齡健康家豬隨機均分為3組，每組4頭?？诜辔附M每豬灌胃1011CFU重組雙歧桿菌[溶于50 mL雙歧桿菌液體培養(yǎng)基(MRS)]，肌肉注射組每豬于豬后腿肌肉注射1011CFU重組雙歧桿菌(溶于10 mL MRS)，對照組每豬灌胃50 mL MRS。每次間隔2周，共免疫2次。于免疫后0、2、4、6和8周進行前腔靜脈采血，采用ELISA法檢測豬血清免疫球蛋白G(IgG)水平；制備豬外周血淋巴細胞(PBMC)，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測豬PBMC增殖水平；收集糞便，測定分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平。結(jié)果 與免疫前和MRS對照組相比，口服灌胃組和肌肉注射組豬血清IgG水平、PBMC增殖水平均在免疫后2～8周升高，6周達較高水平；糞便sIgA水平在免疫后2～8周升高，4周達較高水平，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？诜辔附M的IgG、sIgA水平和PBMC增殖水平顯著高于肌肉注射組(P<0.05)。結(jié)論 豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌可誘導(dǎo)家豬產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，其免疫效果口服灌胃優(yōu)于肌肉注射。

豬帶絳蟲；TSO45W-4B-TSOL18融合基因；重組雙歧桿菌；免疫應(yīng)答

囊尾蚴病是由豬帶絳蟲(Taeniasolium)幼蟲豬囊尾蚴寄生于人體皮下、肌肉、腦和眼等引起的一種嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康的人獸共患寄生蟲病。該病呈世界性分布，我國以東北、華北、西北和西南地區(qū)發(fā)病率較高，因其防治存在化學(xué)藥物的殘留和抗藥性問題，研制疫苗防治該病已成為當(dāng)前研究的熱點[1-4]。雙歧桿菌(bifidobacterium)是人和動物腸道內(nèi)重要的益生菌，近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，選擇具有益生功能的雙歧桿菌作為載體傳遞系統(tǒng)，已在細菌、病毒、寄生蟲和腫瘤等領(lǐng)域構(gòu)建了一系列重組雙歧桿菌[5]。在豬帶絳蟲六鉤蚴階段表達的TSO45W-4B和TSOL18基因與六鉤蚴的入侵密切相關(guān)，具有良好的免疫原性和免疫保護性，是理想的豬帶絳蟲疫苗候選抗原[6-10]。本研究擬在成功構(gòu)建豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌[11-14]的基礎(chǔ)上，將其口服灌胃和肌肉注射免疫家豬，觀察其誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。

1 材料與方法

1.1 疫苗來源 豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌[11-14](以下簡稱為重組雙歧桿菌)由本室制備。

1.2 實驗動物 12頭40日齡健康家豬，體重約為15 kg，購于遵義縣三盆鎮(zhèn)養(yǎng)殖場，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.3 主要試劑和儀器 純化的豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18重組抗原由本室制備[12]。豬血清免疫球蛋白G(IgG)和糞便分泌型免疫球蛋白A(sIgA)檢測試劑盒購自美國Southern Biotech公司，刀豆球蛋白A(ConA)購自美國Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FCS)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司。酶標(biāo)儀購于山東高密彩虹分析儀器有限公司，CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。

1.4 動物分組與免疫 將12頭健康家豬隨機分為3組，每組4頭。免疫前30 min灌胃5% NaHCO3，以中和胃酸?？诜辔附M每豬灌胃1011CFU重組雙歧桿菌[溶于50 mL雙歧桿菌液體培養(yǎng)基(MRS)]，肌肉注射組每豬于豬后腿肌肉注射1011CFU重組雙歧桿菌(溶于10 mL MRS)，對照組每豬灌胃50 mL MRS。每次間隔2周，共免疫2次。

1.5 豬血清IgG和糞便sIgA水平檢測 于免疫后0、2、4、6、8周從豬前腔靜脈采血2～2.5 mL，4oC靜置12 h，1 018 ×g離心10 min，分離血清，-20oC凍存待檢。收集各組糞便0.1 g，用0.01 mol/mL磷酸鹽緩沖液(PBS)200 μL懸浮，4 ℃靜止30 min，充分混勻，509 ×g離心15 min，收集上清，-20 ℃凍存。采用豬血清免疫球蛋白G(IgG)和糞便分泌型免疫球蛋白A(sIgA)檢測試劑盒進行檢測，具體按試劑盒說明書進行操作。

1.6 豬外周血淋巴細胞(PBMC)制備 于免疫后0、2、4、6、8周從豬前腔靜脈采血1～2 mL，置于無菌乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內(nèi)，用含10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋2倍。按2∶1體積緩慢加至淋巴細胞分離液液面上，636 ×g離心20 min，吸取上下液體交界處白膜層。用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋5倍，洗滌2次，并用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5×106/mL。

1.7 豬PBMC增殖水平檢測 將5×106/mL豬PBMC加入24孔細胞培養(yǎng)板上，分別加入1 mL原液、1 mL原液+10 μL豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18重組抗原(1 μg/μL)、1 mL原液+10 μL ConA(1 μg/μL)。于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h。每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。輕輕倒置細胞培養(yǎng)板，控干液體，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，輕輕振蕩，溶解沉淀。測定每孔吸光度(A630值)。

2 結(jié)果

2.1 豬血清IgG水平 結(jié)果顯示，口服灌胃組和肌肉注射組血清IgG水平在免疫后2～8周升高，6周達較高水平，與免疫前和MRS對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫后2、4、6和8周，口服灌胃組血清IgG水平顯著高于肌肉注射組(P<0.05，見表1)。

表1 豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌免疫家豬后血清IgG水平(n=4，μg/mL)

免疫后周數(shù)口服灌胃組肌肉注射組MRS對照組0208．86±3．08206．19±1．83207．00±4．682230．86±3．08ab220．78±2．97a206．86±1．004270．01±2．82ab260．08±3．80a207．97±3．936306．05±2．90ab281．29±4．85a209．13±3．828290．95±0．51ab271．19±0．18a204．50±0．38

與免疫0周和MRS對照組比較，aP<0.05；與肌肉注射組比較，bP<0.05。

2.2 豬糞便sIgA水平 結(jié)果顯示，口服灌胃組和肌肉注射組糞便sIgA水平在免疫后2～8周升高，4周達較高水平，與免疫前和MRS對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫后2、4、6和8周，口服灌胃組糞便sIgA水平顯著高于肌肉注射組(P<0.05，見表2)。

表2 豬帶絳蟲重組TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌免疫家豬后糞便sIgA水平(n=4，μg/mL)

免疫后周數(shù)口服灌胃組肌肉注射組MRS對照組014．08±0．1314．23±0．2914．21±0．31218．07±0．36ab17．03±0．14a14．20±0．31420．69±0．58ab19．10±0．51a14．24±0．29616．77±0．32ab16．99±0．32a14．24±0．29815．95±0．51ab15．19±0．18a14．50±0．38

與免疫0周和MRS對照組比較，aP<0.05；與肌肉注射組比較，bP<0.05。

2.3 豬PBMC增殖水平 結(jié)果顯示，口服灌胃組和肌肉注射組PBMC增殖水平在免疫后2～8周升高，6周達較高水平，與免疫前和MRS對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫后2、4、6和8周，口服灌胃組顯著高于肌肉注射組(P<0.05，見表3)。

表3 豬帶絳蟲重組TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌免疫家豬后PBMC增殖水平(n=4，A630值)

免疫后周數(shù)口服灌胃組原液抗原刺激ConA刺激肌肉注射組原液抗原刺激ConA刺激MRS對照組原液抗原刺激ConA刺激00．161±0．0050．163±0．0060．164±0．0060．163±0．0030．162±0．0040．163±0．0050．167±0．0020．163±0．0050．162±0．00520．363±0．006ab0．582±0．048ab0．656±0．070ab0．262±0．004a0．491±0．026a0．556±0．024a0．163±0．0050．162±0．0040．163±0．00340．892±0．450ab1．556±0．046ab1．649±0．073ab0．664±0．080a1．414±0．078a1．504±0．055a0．163±0．0050．163±0．0050．164±0．00661．164±0．006ab1．999±0．756ab2．218±0．067ab0．938±0．048a1．806±0．043a1．951±0．052a0．162±0．0050．165±0．0030．162±0．00580．936±0．052ab1．788±0．060ab1．829±0．078ab0．713±0．060a1．664±0．042a1．738±0．032a0．167±0．0020．164±0．0030．160±0．005

與免疫0周和MRS對照組比較，aP<0.05；與肌肉注射組比較，bP<0.05。

3 討論

不同接種途徑涉及不同抗原提呈，可產(chǎn)生不同強度、不同類型的免疫應(yīng)答。腸上皮細胞和腸黏膜下集合淋巴結(jié)是誘導(dǎo)腸道黏膜免疫反應(yīng)的主要部位。腸上皮細胞不僅具有吸收腸腔內(nèi)各種抗原功能，還具有攝取和釋放sIgA、提呈抗原、分泌細胞因子等免疫功能。進行肌內(nèi)注射免疫，抗原在骨骼肌細胞中表達，肌肉組織可長期表達蛋白質(zhì)，其應(yīng)答水平可維持較長時間[15-19]。

sIgA是黏膜免疫應(yīng)答發(fā)生的重要標(biāo)志。IgG是評價系統(tǒng)免疫應(yīng)答的重要指標(biāo)和體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體。黏膜免疫后IgG抗體形成細胞主要進入血循環(huán)，并歸巢至系統(tǒng)淋巴結(jié)或組織炎癥部位。而sIgA抗體形成細胞歸巢至黏膜效應(yīng)部位，當(dāng)再次遇到相同抗原時分泌大量sIgA。

鑒于合適的免疫途徑對充分發(fā)揮疫苗的免疫效應(yīng)至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，免疫后2、4、6和8周，口服灌胃組豬血清IgG、糞便sIgA和PBMC增殖水平均顯著高于肌肉注射組，表明豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌口服灌胃和肌肉注射均可誘導(dǎo)家豬產(chǎn)生系統(tǒng)免疫、黏膜免疫和細胞免疫，且口服灌胃優(yōu)于肌肉注射，說明口服灌胃是較為合適的免疫途徑。

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[收稿2015-02-11;修回2015-03-27]

(編輯：譚秀榮)

Immune responses induced by recombinant bifidobacterium of TSO45W-4B-TSOL18 fusion gene ofTaeniasoliumin domestic pigs

ZhouBiying,LiuMeichen,WanXiaobo

(Department of Parasitology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To observe the immune responses induced by recombinant bifidobacterium of TSO45W-4B-TSOL18 fusion gene ofTaeniasoliumin domestic pigs through oral administration and intramuscular injection.Methods Twelve healthy 40-day-old domestic pigs were randomly divided into 3 groups with each group of 4 pigs:oral administration group giving 1011CFU recombinant bifidobacterium dissolved in 50 ml bifidobacterium liquid medium, MRS; intramuscular injection group giving 1011CFU recombinant bifidobacterium dissolved in 10 ml MRS; oral administration control group giving 50 ml MRS.All groups were immunized twice,once every two weeks. On 0th,2th,4th,6thand 8thweek after immunization, the sera was collected from precaval vein to detect the level of immunoglobulin G (IgG) using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Peripheral blood lymphocytes (PBMC) were prepared to detect the level of proliferation using methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. The feces of pig were collected to detect the level of secreted immunoglobulin A (sIgA) using ELISA.Results The level of IgG in sera increased during 2～8thweek, and reached the higher level in 6thweek. The level of PBMC proliferation increased during 2～8thweek, and reached the higher level in 6thweek. The level of sIgA in feces increased during 2～8thweek ,and reached the higher level in 4thweek, compared with those in preimmune and MRS control groups,the difference was significant(P<0.05). The level of sera IgG, PBMC proliferation or fece sIgA in oral administration group was significantly higher than those in intramuscular injection group (P<0.05).Conclusion The recombinant bifidobacterium of TSO45W-4B-TSOL18 fusion gene ofTaeniasoliumcould induce effective immune responses in domestic pigs,and the immune effects in oral administration group is better than those in intramuscular injection group.

bifidobacterium; TSO45W-4B-TSOL18 fusion gene; recombinant bifidobacterium;immune response

國家自然科學(xué)基金資助項目(NO:81160206)；貴州省科技廳科學(xué)技術(shù)基金資助項目(NO:黔科合J[2014]2178)。

周必英，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，病原生物學(xué)術(shù)帶頭人，現(xiàn)任遵義醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室副主任。貴州省醫(yī)學(xué)會熱帶病與寄生蟲學(xué)分會委員，《重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》《遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報》審稿人。主要從事寄生蟲感染與免疫研究，獲國家級、省市級等各級科研項目近10項，發(fā)表科研論文40余篇，獲貴州醫(yī)學(xué)科技獎三等獎1項。

R383.32

A

1000-2715(2015)02-0117-04