葛 斌，楊智敏，刁 英，楊名慧，宮黎明，石 燕

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 生殖中心，貴州 遵義 563099)

技術(shù)與方法

D3卵裂期胚胎玻璃化冷凍技術(shù)在IVF實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用

葛 斌，楊智敏，刁 英，楊名慧，宮黎明，石 燕

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 生殖中心，貴州 遵義 563099)

目的 探討玻璃化冷凍技術(shù)在人類卵裂期胚胎凍存中的應(yīng)用價(jià)值。方法 回顧性分析本中心261個(gè)冷凍胚胎復(fù)蘇周期，比較2種冷凍方法的胚胎存活率、完好率、妊娠率和種植率等數(shù)據(jù)。結(jié)果 玻璃化冷凍組的存活率(97.11%)、完好率(89.02%)和種植率(23.12%)顯著高于程序化組(91.31%、63.73%、16.31%)(P<0.05)，而妊娠率和平均年齡、平均移植胚胎數(shù)、平均內(nèi)膜厚度兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(40.26%vs40.22%、31.3±5.3vs32.2±5.5、2.25±0.55vs2.27±0.70、8.9±1.1vs9.1±1.6) (P>0.05)。結(jié)論 玻璃化冷凍是卵裂期胚胎保存的優(yōu)選方法。

卵裂期胚胎；玻璃化更冷凍；程序化冷凍

卵裂期胚胎冷凍是輔助生殖技術(shù)中不可缺少的重要組成部分，它可以使患者在一個(gè)超排降調(diào)周期內(nèi)進(jìn)行多次移植，增加單次助孕周期的總?cè)焉锫什⒛苡行П苊馀咛ミ^度浪費(fèi)[1]。實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)的程序化冷凍(programmed freezing)要求精密昂貴的設(shè)備,且操作過程繁瑣，對(duì)液氮的消耗大。近年來出現(xiàn)的玻璃化冷凍(vitrified cryopreservation)技術(shù)已經(jīng)被越來越多的生殖中心采用。玻璃化冷凍技術(shù)是利

用微小冷凍載體在極快速降溫過程中使高濃度的冷凍液變成一種高粘度的介于液態(tài)與固態(tài)之間、非晶體、透明的玻璃態(tài)，達(dá)到冷凍保護(hù)的作用。與程序化冷凍相比，具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是否能得到理想的臨床妊娠率和胚胎種植率，尚需要研討。本研究回顧性分析本生殖中心261個(gè)復(fù)蘇周期的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室和臨床指標(biāo)，比較程序化冷凍和玻璃化冷凍對(duì)卵裂期胚胎的冷凍復(fù)蘇效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2014年2月至8月在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心接受凍胚復(fù)蘇移植(frozen thawed embryotransfer,FET)的患者261例645枚胚胎，根據(jù)冷凍方法不同分為兩組：程序化冷凍復(fù)蘇184個(gè)周期(472枚)，玻璃化冷凍復(fù)蘇77周期(173枚)。

1.2 試劑和方法

1.2.1 胚胎冷凍 (1)程序化冷凍試劑實(shí)用Quinn′s冷凍培養(yǎng)基。冷凍方法：①脫水程序(室溫下)：胚胎轉(zhuǎn)移在溶液Ⅰ(HEPES-HTF+20%SPS)、溶液Ⅱ(0.5M PROH)、溶液Ⅲ(1.0M PROH)中各停留5 min,溶液Ⅳ(1.5M PROH)停留10 min，溶液Ⅵ(1.5M PROH-0.1M蔗糖)停留5 min。②胚胎裝載與上機(jī)：將胚胎裝入脈管中放入冷凍儀中，從室溫以-2 ℃/min速率降至-7 ℃，保持5 min后行人工誘導(dǎo)結(jié)晶(植冰)，以-0.3 ℃/min降至-30 ℃，再以-50 ℃/min速率降至-150 ℃，停留10 min后投入液氮保存。(2)玻璃化冷凍試劑實(shí)用日本KITAZATO試劑盒。冷凍方法：①胚胎平衡(37℃)：將胚胎轉(zhuǎn)移到Ⅰ號(hào)液體停留1 min(HEPES-HTF+20%SPS)，②胚胎脫水并裝載(37 ℃)：將胚胎在Ⅱ號(hào)溶液(Equilibration Solution,ES)中停留2 min，再轉(zhuǎn)移至Ⅲ號(hào)溶液(Vitrification Solution,VS)停留不超過1 min后裝載到載桿上直接投入液氮保存。

1.2.2 胚胎解凍 (1)程序化解凍方法：①反脫水程序(室溫下)將從液氮中取出的胚胎先后放入解凍溶液Ⅱ(1.0M PROH-0.2M蔗糖)、溶液Ⅲ(0.5M PROH-0.2M蔗糖)、溶液Ⅳ(0.2M蔗糖)中各停留5 min，溶液Ⅰ(HEPES-HTF+20%SPS)中停留10 min。②升溫：將含有胚胎的解凍培養(yǎng)基從室溫緩慢升至37℃(在大恒溫板上進(jìn)行)，行激光輔助孵化后放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中等待移植。(2)玻璃化解凍方法(37 ℃下進(jìn)行)：將胚胎從液氮罐中取出以此放入溶液Ⅰ(0.5M蔗糖)和溶液Ⅱ(0.35M蔗糖)中各停留1 min，溶液Ⅲ(0.25M蔗糖)中停留3 min，溶液Ⅳ(HTF+HSA)中停留5 min并洗滌數(shù)次，行激光輔助孵化后放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中等待移植。

1.2.3 觀察指標(biāo) 胚胎存活率：存活胚胎數(shù)(卵裂球存活數(shù)目≥50%即為存活)/解凍胚胎數(shù)×100%；胚胎完好率：完好胚胎數(shù)(所有卵裂球都存活)/解凍胚胎數(shù)×100%；妊娠率：臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；種植率：妊娠胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，均數(shù)間比較用t檢驗(yàn)，率之間用2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組間臨床資料對(duì)比 2014年2月至8月共解凍261個(gè)周期，程序化解凍184個(gè)周期，平均年齡32.2±5.5歲，玻璃化解凍77個(gè)周期，平均年齡31.3±5.3歲，組間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；程序化解凍周期平均內(nèi)膜厚度8.9±1.1 mm，玻璃化解凍周期平均內(nèi)膜厚度9.1±1.6 mm，組間內(nèi)膜厚度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；程序化解凍平均移植胚胎數(shù)2.27±0.70個(gè)，玻璃化解凍平均移植胚胎數(shù)2.25±0.55個(gè)，組間平均移植個(gè)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，見表1)。

表1 程序化冷凍組與玻璃化冷凍組臨床資料對(duì)比

組別例數(shù)年齡(歲)內(nèi)膜厚度(mm)平均移植數(shù)(個(gè))程序化冷凍18432．2±5．59．1±1．62．27±0．70玻璃化冷凍7731．3±5．38．9±1．12．25±0．55

與程序化冷凍比較,P均>0.05。

2.2 兩組間實(shí)驗(yàn)室資料對(duì)比 程序化解凍胚胎472枚，存活胚胎數(shù)431枚，存活率為91.31%，玻璃化解凍胚胎數(shù)173枚，存活胚胎數(shù)168枚，存活率為97.11%，兩組間存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；程序化解凍胚胎完好數(shù)310枚，完好率63.77%，玻璃化解凍胚胎完好數(shù)154枚，完好率89.02%，兩組間完好率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；程序化解凍妊娠周期74例，妊娠率40.21%，玻璃化解凍妊娠周期31例，妊娠率40.26%，兩組間妊娠率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；程序化解凍種植胚胎數(shù)77個(gè)，種植率16.31%，玻璃化解凍胚胎種植數(shù)40個(gè)，種植率23.12%，兩組間種植率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 程序化冷凍組與玻璃化冷凍組實(shí)驗(yàn)室資料對(duì)比

組別例數(shù)存活率(%)完好率(%)妊娠率(%)種植率(%)程序化冷凍47291．3163．7340．2216．31玻璃化冷凍17397．11?89．02??40．2623．12?PP<0．05P<0．05P>0．05P<0．05

*P<0.05, **P<0.01,與程序化冷凍相比。

3 討論

卵裂期胚胎冷凍保存是人類輔助生殖技術(shù)中一個(gè)極其重要的核心技術(shù)，它可以增加IVF累計(jì)成功率，預(yù)防嚴(yán)重卵巢過度刺激征，便于進(jìn)行移植前胚胎遺傳學(xué)診斷(PGD)技術(shù)的操作[2]。長(zhǎng)時(shí)間來，IVF實(shí)驗(yàn)室一直采用程序化冷凍方法進(jìn)行胚胎凍存，此方法是用程序降溫儀緩慢使溫度由室溫降至-150℃，耗時(shí)長(zhǎng)且液氮消耗量大，且冷凍過程中產(chǎn)生的冰晶會(huì)對(duì)胚胎造成很大損傷[3]。各生殖中心實(shí)驗(yàn)室均需要需找一種更好的冷凍方法來提高胚胎解凍后的存活率和完好率。因此，玻璃化冷凍技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，玻璃化冷凍技術(shù)原理是用高濃度的冷凍液將細(xì)胞內(nèi)的水分置換出來，經(jīng)過急速降溫將由液態(tài)轉(zhuǎn)化為類似玻璃狀非晶體化狀態(tài)，冷卻過程中避免了冰晶形成對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的損傷，保留細(xì)胞體內(nèi)外液體正常的分子和離子分布[4]。

Mukaida在1998年首次報(bào)道玻璃化冷凍人類卵裂期胚胎成功妊娠后，玻璃化冷凍技術(shù)在全球生殖中心IVF實(shí)驗(yàn)室內(nèi)迅速被推廣并應(yīng)用。我國(guó)首例玻璃化冷凍胚胎并成功分娩在2004被王俊霞報(bào)道[5]。目前，玻璃化冷凍技術(shù)除了運(yùn)用于冷凍卵裂期胚胎外，也被一些中心用作囊胚冷凍和卵子冷凍的主要方法[6]。有國(guó)外學(xué)者研究表明, 玻璃化冷凍 4c期胚胎其存活率顯著比程序化冷凍高, 但臨床妊娠率和胚胎種植率與程序化冷凍間無顯著差異[7]，Balaban[8]也得到了相似的結(jié)果；但Mojtaba 等[9]在玻璃化法冷凍8 c期胚胎中發(fā)現(xiàn)著床率和臨床妊娠率和程序化冷凍間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與Nina等[10]報(bào)道的結(jié)果一致。

本研究中，程序化冷凍組和玻璃化冷凍組之間的胚胎存活率、完好率和種植率均有顯著差異(P<0.05)，這一結(jié)論與鄭愛燕[1]等人的研究結(jié)果一致。玻璃化冷凍保護(hù)劑濃度高, 卵裂球脫水充分,另一方面由于溫度快速下降,不易形成冰晶, 減少了胚胎或細(xì)胞的機(jī)械性損傷, 因此復(fù)蘇胚胎存活率和完好率明顯高于程序化組。而完好胚胎和存活胚胎提示具有較好的耐受凍融的能力,同時(shí)也反映了胚胎良好的發(fā)育潛能,這就解釋了為何玻璃化冷凍的種植率高于程序化冷凍。但是妊娠率無顯著差異(P>0.05)，分析原因可能由于本中心開展玻璃化冷凍技術(shù)時(shí)間較晚、數(shù)據(jù)較少等原因所致。

雖然玻璃化冷凍耗時(shí)少、成本低且能避免冰晶形成，理論上是胚胎冷凍的理想方法，但是在操作過程中含有胚胎的液滴直接與液氮接觸，不能完全避免交叉感染的潛在風(fēng)險(xiǎn)[11-12]。而且玻璃化冷凍中高濃度冷凍保護(hù)劑不可避免會(huì)對(duì)胚胎造成細(xì)胞毒性損傷，程序化冷凍主要采用毒性較小、濃度較低的丙二醇作為胚胎冷凍的冷凍劑, 而玻璃化冷凍液里含有高濃度滲透性抗凍劑的DMSO,而DMSO具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性, 雖然DMSO能帶來很好的冷凍效果,但是這種毒性作用對(duì)細(xì)胞能產(chǎn)生一定的損傷。Courtney等[13]發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍對(duì)鼠胚植入前的發(fā)育能力和種植潛能幾乎沒有影響。Takahashi 等[14]報(bào)道玻璃化冷凍分娩的嬰兒發(fā)生生理缺陷概率與自然妊娠組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是這些研究缺少大樣本量的數(shù)據(jù)及對(duì)子代的長(zhǎng)期隨訪。

綜上，玻璃化冷凍是近年來開展的一種新的冷凍技術(shù)，冷凍效果優(yōu)于程序化冷凍，但是對(duì)子代的長(zhǎng)期隨訪報(bào)道很少，在玻璃化冷凍形成常規(guī)冷凍方法之前，有必要對(duì)子代做充分的后續(xù)研究和分析評(píng)估。

[1] 鄭愛燕，丁潔，顧斌，等.玻璃化冷凍與程序化冷凍對(duì)胚胎發(fā)育潛能及臨床結(jié)局的影響[J].生殖與避孕，2013,33(1)：16-19.

[2] 許偉標(biāo)，楊桂艷，鄭煜麗． 卵巢過度刺激綜合征全胚胎冷凍后首次凍融移植臨床分析[J]． 中華臨床醫(yī)師雜志，2011，5( 1) : 236 -238．

[3] 黃國(guó)寧，孫海翔. 體外受精-胚胎移植實(shí)驗(yàn)室技術(shù)[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2012: 244.

[4] Rezazadeh Valojerdi M， Eftekhari-Yazdi P， Karimian L， et al．Vitrification versus slow freezing gives excellent survival，postwarming embryo morphology andpregnancy outcomes for humancleaved embryos [J]. J Assist Reprod Genet, 2009, 26 (6)：347 -354．

[5] 王俊霞，朱桂金，魏玉蘭，等. 應(yīng)用胚胎玻璃化冷凍技術(shù)獲得臨床妊娠及分娩1例[J]. 中華婦產(chǎn)科雜志，2004，39 ( 2) : 143.

[6] Zhu D，Zhang J，Cao S，et al. Vitrification - warmed blastocystransfer cycles yield higher pregnancy and implantationrates compared with fresh blastocyst transfer cycles: time for a new embryo transfer strategy[J]. Fertil Steril, 2011, 95(5):1691.

[7] Kuwayama M, Vajta G, Ieda S, et al. Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and the elimination of potential contamination[J]. Reprod Biomed Online, 2005, 11(5):608-614.

[8] Balaban B, Urman B, Ata B, et al. A randomized controlled study of human day 3 embryo cryopreservation by slow freezing or vitrification: vitrification is associated with higher survival, metabolism and biastocyst formation[J]. Hum Reprod,2008, 23(9):1976-1982.

[9] Mojtaba R V,Poopak E Y,Leita K,et al.Vitrification versus slaw freezing gives excellent surival,post warming enbryo morphology and pregnancy outcomes for human cleaved embryos[J].Assist Reprod Genet,2009,26(6):347-354.

[10] Nina D. Cryoloop vitrification of human day 3 cleavage stage embryos： post-vitrification development，pregnancy outcomes and livebirths[J]. Reprod Biomed Online, 2007, 14(2):208-213.

[11] Yavin S，Aroyo A，Roth Z，et al.Embryo cryopreservation in the presence of low concentration of vitrification solution with sealed pulled straws in liquid nitrogen slush[J]. Hum Repord, 2009, 24 ( 4):797-804．

[12] Bielanski A，Vajta G.Risk of contamination of germplasm during cryopreservation and cryobanking in IVF units[J]. Hum Reprod，2009，24( 10): 2457-2467．

[13] Sheehan C B,Lane M,Gardner D K.The cryoloop facilitates revitrification of embryos at four successive stages of development without impairing embryo growth [J]. Hum Reprod，2006，21( 11):2978-2984.

[14] Takahashi K，Mukaida T，Goto T,et al. Perinatal outcome of blastocyst transfer with vitrification using cryoloop: a 4-year follow-up study[J]. Fertil Steril，2005，84 (1):88.

[收稿2014-11-25;修回2015-01-20]

(編輯：王福軍)

Application of D3 cleavage stage embryo vitrification freezing technology in IVF laboratories

GeBin,YangZhimin,DiaoYing,YangMinghui,GongLiming,ShiYan

(Reproductive Centre, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To explore the development potential of embryo and its breadboard outcome after cryopreservation with vitrification and programmed freezing methods.Methods In the retrospective study, a total of 261 frozen embryos were studied. The ratio of embryos survival, blastomere integrity, implantation and clinical pregnancy were compared between these two methods.Results Compared with the programmed frozen embryos, the Vitrified embryos had a higher survival rate (97.11% vs 91.31%), blastomere integrity rate (89.02% vs 63.73%) and implantation rate (23.12% vs 16.31%) (P<0.05). However, there was no significant difference in clinical pregnancy rate(40.26% vs 40.21%), the average number of transferred embryos (2.25±0.55 vs 2.27±0.70), the average age(31.3±5.3 vs 32.2±5.5)and the endometrial thickness (8.9±1.1 vs 9.1±1.6) between these two different freezing methods (P>0.05).Conclusion The outcome of vitrification is better than the programmed freezing method.

cleavage stage embryos; vitrification; programmed freezing

遵義醫(yī)學(xué)院碩士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(NO:2007-54)。

楊智敏，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：輔助生殖技術(shù)，E-mail:yangzhimin8@126.com。

R321.3

A

1000-2715(2015)02-0193-04