顧生玖，李美波，許有瑞，朱開梅

(桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541004)

虎杖白藜蘆醇對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞株增殖和生長(zhǎng)周期的影響*

顧生玖，李美波，許有瑞，朱開梅

(桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541004)

目的 探討虎杖中白藜蘆醇對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞株增殖和生長(zhǎng)周期的影響。方法 采用微波輔助法提取虎杖中白藜蘆醇，將12.5，25.0，50.0，100.0 μmol·L-1白藜蘆醇作用人肝癌HepG-2細(xì)胞，采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)虎杖中白藜蘆醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2細(xì)胞抑制增殖作用，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期的分布。結(jié)果 虎杖中白藜蘆醇能顯著抑制HepG-2細(xì)胞的生長(zhǎng)，并呈現(xiàn)時(shí)間-濃度依賴性。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，白藜蘆醇作用于細(xì)胞HepG-2且細(xì)胞被阻滯于S期，呈現(xiàn)出劑量依賴性。不同藥物濃度白藜蘆醇(12.5，25.0，50.0，100.0 μmol·L-1)作用人肝癌HepG-2細(xì)胞株48 h后，隨著藥物濃度的增大，G0/G1期的比例逐漸減小，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞S期的比例隨著濃度增大而增加，分別達(dá)到(44.82±1.21)%，(54.00±1.71)%，(65.21±3.66)%，(77.50±4.21)%，與對(duì)照組(34.75±3.92)%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 虎杖中白藜蘆醇能明顯抑制肝癌HepG-2細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡，可引起肝癌HepG-2細(xì)胞的S期阻滯。

虎杖；白藜蘆醇；HepG-2細(xì)胞；細(xì)胞周期

虎杖是臨床常用中藥材，為蓼科蓼屬多年生草本植物虎杖PolygonumCuspidatumSieb.et Zucc 的干燥根莖和根。我國(guó)大部分地區(qū)均產(chǎn)，主產(chǎn)于江蘇、江西、山東、四川等地。別名陰陽(yáng)蓮、苦杖、酸杖、斑杖、土大黃、大葉蛇總管等，入藥始見于《雷公炮炙論》[1]?；⒄戎兄饕祯?、二苯乙烯類、黃酮類、鞣質(zhì)等多酚性化合物[2-3]，以白藜蘆醇含量最高。白藜蘆醇(resveratrol)是一種天然的蒽醌萜類化合物。最近研究表明，白藜蘆醇具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能及保護(hù)心血管等作用[4-5]，并在癌前病變腫瘤的起始及演變階段均有抑制作用，具有良好的癌癥預(yù)防及治療前景[6]，是一種極具開發(fā)價(jià)值的天然物質(zhì)，被喻為繼紫杉醇之后的又一新的綠色抗癌物質(zhì)。肝癌是一種常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人們的健康和生命。筆者擬在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇虎杖白藜蘆醇和肝癌HepG-2細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察虎杖白藜蘆醇對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和周期的影響，初步探討虎杖白藜蘆醇用于肝癌治療的可能性。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 虎杖，于2011年11月采集于桂林醫(yī)學(xué)院藥用植物園，由藥學(xué)院天然藥化教研室付鵬博士鑒定為蓼科植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.)的根莖及根，將樣品陰干，粉碎過(guò)內(nèi)徑(150.0±6.6) μm(100目)篩，備用；白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(上海哈靈生物科技有限公司，含量：99.9%，批號(hào)：111535-200502)；虎杖中白藜蘆醇由本實(shí)驗(yàn)室提取，溶解于二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)備用；噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT，美國(guó)Amresco公司，批號(hào)：0782)；DMSO(美國(guó)Amresco公司，批號(hào)：3557A37)；1640培養(yǎng)基(RPMI-1640，美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：1403233)；胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技有限公司，批號(hào)：100421)；碘化丙啶(propidium iodide，PI，美國(guó)Amresco公司，批號(hào)：0975)；實(shí)驗(yàn)中其余試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞株及培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG-2由桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)。人肝癌HepG-2細(xì)胞用含10%FBS、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合狀態(tài)達(dá)80%～90%時(shí)用胰酶消化后傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)，Laborota 4000 efficient)；210型高效色譜儀(美國(guó)VARIAN公司)；NJL07-3型微波爐(南京杰全微波設(shè)備有限公司)；DG3002型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(國(guó)營(yíng)華東電子管廠)；FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；XF-20旋風(fēng)醫(yī)藥粉碎機(jī)(黃驟市振興機(jī)電儀器廠)；Axiover-40倒置相差顯微鏡(德國(guó)蔡司公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)。

1.4 虎杖白藜蘆醇的提取 準(zhǔn)確稱取干燥的虎杖粉末10 g，加入20倍70%乙醇溶液浸泡4 h，在微波功率100 W，25 ℃條件下萃取10 min后，稍冷，過(guò)濾。收集濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)乙醇至濃縮液無(wú)醇味。將乙醇濃縮液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層，在40 ℃下減壓蒸餾至干，最后得到白藜蘆醇(純度：94.62%)。

1.5 色譜條件 色譜柱為Eclipse XDB-C8柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(35：65)，流速1.0 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)303 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.6 溶液的制備

1.6.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用甲醇溶解并定容于50 mL量瓶中，得到100 mg·L-1的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.6.2 供試品溶液的制備 精密稱取白藜蘆醇提取物5 mg，用甲醇溶解并定容到10 mL量瓶，經(jīng)內(nèi)徑0.45 μm微孔膜濾過(guò)。

1.7 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加入10 mL量瓶，加甲醇至10 mL量瓶，定容，得到2，4，6，8，10 mg·L-1的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。按“1.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=57.45X-0.000 01(r=0.999 3)。白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品在濃度0.001～0.012 g·L-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.8 加樣回收率考察 準(zhǔn)確稱取同一批虎杖樣品5份，每份各10 g，分別精密加入一定量對(duì)照品溶液，按照“1.6”的方法得到待測(cè)液，按“1.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，白藜蘆醇平均回收率為98.99%，RSD=0.99%。

1.9 MTT法測(cè)定虎杖中白藜蘆醇對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞株增殖的抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將人肝癌HepG-2細(xì)胞株濃度調(diào)整為2×104個(gè)·mL-1，按每孔100 μL接種于96孔板，每組設(shè)復(fù)孔5個(gè)。置于37 ℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，吸除培養(yǎng)液，分別加入不同濃度白藜蘆醇使其終濃度為12.5，25.0，50.0及100.0 μmol·L-1，并同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(不加藥)，分別培養(yǎng)24，48和72 h后，每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL終止培養(yǎng)，于37℃孵育4 h，吸取上清液，每孔再加入DMSO150 μL，輕微振蕩，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處吸光度(A)值，并計(jì)算細(xì)胞抑制率。重復(fù)測(cè)量3次，取其平均值。抑制率(%)=(對(duì)照組A490-實(shí)驗(yàn)組A490)/對(duì)照組A490×100%。

1.10 倒置相差顯微鏡下觀察白藜蘆醇對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞株形態(tài)的影響 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肝癌HepG-2細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞完全貼壁后，吸除培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的白藜蘆醇，使其終濃度為12.5，25.0，50.0及100.0 μmol·L-1，并同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(不加藥)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后去掉培養(yǎng)液，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并攝像。

1.11 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)PI單標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞周期 按“1.2”項(xiàng)下方法培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，1 000 r·min-1離心10 min，離心半徑17.2 cm，棄上清液，再加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered salution，PBS)5 mL，再次離心，棄上清液，用預(yù)冷的PBS 1 mL重懸細(xì)胞，加入70%冰乙醇(-20 ℃)固定24 h。檢測(cè)前2 000 r·min-1，離心半徑17.2 cm，離心5 min去乙醇。用PBS洗滌2次，加入含有終濃度為50.0 μg·mL-1PI和100.0 μg·mL-1RNase A，4 ℃避光染色1 h，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞株增殖的影響 虎杖中白藜蘆醇對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見圖1?；⒄戎邪邹继J醇對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞的增殖有抑制作用，且隨著藥物濃度的升高或時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率逐漸增加。當(dāng)白藜蘆醇濃度達(dá)到50.0，100.0 μmol·L-1時(shí)，其對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。100.0 μmol·L-1白藜蘆醇作用于HepG-2細(xì)胞48和72 h，對(duì)細(xì)胞抑制率分別達(dá)48.73%，58.75%。

2.2 HepG-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 經(jīng)不同濃度白藜蘆醇孵育HepG-2細(xì)胞24 h后，倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)變化，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示：未添加白藜蘆醇的陰性對(duì)照組，HepG-2細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞排列緊密、邊界清楚，細(xì)胞飽滿呈現(xiàn)多邊形或梭形，細(xì)胞密度大。白藜蘆醇12.5 μmol·L-1組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化與對(duì)照組相比，變化不明顯。其余組細(xì)胞貼壁數(shù)量均有不同程度的減少，細(xì)胞排列紊亂，50.0和100.0 μmol·L-1組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯較陰性對(duì)照組差，細(xì)胞皺縮，貼壁不佳，細(xì)胞間隙變大，脫落明顯增多，胞液中有漂浮的細(xì)胞。

圖1 白藜蘆醇對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞增殖的影響

Fig.1 Effect of Resveratrol on the growth of HepG-2 cells

2.3 虎杖中白藜蘆醇對(duì)HepG-2細(xì)胞的細(xì)胞周期影響及結(jié)果分析 HepG-2細(xì)胞經(jīng)不同濃度白藜蘆醇作用48 h后，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞周期分布，結(jié)果見圖3和表1。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：隨著藥物作用濃度增大，G0/G1期細(xì)胞的比例逐漸減小，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞S期的比例隨著濃度增大而增加，與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中50.0 μmol·L-1，100.0 μmol·L-1組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各濃度組間比較，隨著藥物濃度增高，S期細(xì)胞比例逐漸增加，表現(xiàn)出一定的濃度依賴性。不同濃度細(xì)胞G2/M期比例有差異，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)細(xì)胞周期結(jié)果分析顯示，白藜蘆醇可影響HepG-2細(xì)胞周期的分布，將HepG-2細(xì)胞阻滯在S期。

A.陰性對(duì)照組；B.25.0 μmol·L-1白藜蘆醇組；C.50.0 μmol·L-1白藜蘆醇組；D.100.0 μmol·L-1白藜蘆醇組

A.陰性對(duì)照組；B.12.5 μmol·L-1白藜蘆醇組；C.25.0 μmol·L-1白藜蘆醇組；D.50.0 μmol·L-1白藜蘆醇組；E.100.0 μmol·L-1白藜蘆醇組

圖3 不同濃度白藜蘆醇作用肝癌HepG-2細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期分布

A.negative control group;B.12.5 μmol·L-1resveratrol group；C.25.0 μmol·L-1resveratrol group；D.50.0 μmol·L-1resveratrol group; 100.0 μmol·L-1resveratrol group

Fig.3 Cell cycle distribution of HepG-2 cells after 48 h treatment by different concentration of resveratrol

表1 5組HepG-2細(xì)胞經(jīng)作用48 h后不同周期細(xì)胞所占比例測(cè)定結(jié)果

與陰性對(duì)照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with negative control group，*1P<0.05，*2P<0.01

3 討論

原發(fā)性肝癌是常見惡性腫瘤之一，我國(guó)是肝癌高發(fā)區(qū)，發(fā)病率占世界肝癌總數(shù)的43.7%，南方地區(qū)發(fā)病率更高[7]。原發(fā)性肝癌具有早期診斷困難，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，常規(guī)放、化療藥物作用局限，預(yù)后差等特點(diǎn)。中藥可以彌補(bǔ)手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療的不足，既能鞏固放療化療的效果，又能消除放、化療的毒副作用，更重要的是可以切斷癌細(xì)胞的復(fù)制功能[8]。因此，尋找毒副作用小，效果明顯的抗癌藥物就成為了研究重點(diǎn)。最近研究顯示，白藜蘆醇能抑制多種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系的增殖如宮頸癌、腎細(xì)胞癌[9-10]等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示虎杖中白藜蘆醇能抑制肝癌HepG-2細(xì)胞株的增殖，且對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用有時(shí)間和劑量依賴性，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)和作用濃度增加，抑制作用明顯增強(qiáng)，提示可直接作用于腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。當(dāng)藥物濃度達(dá)到100.0 μmol·L-1時(shí)，作用72 h后對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞株的抑制率可達(dá)到58.75%，顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。有學(xué)者進(jìn)行DNA微陣列分析乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，研究白藜蘆醇的抗腫瘤可能機(jī)制，但具體作用機(jī)制仍需深入探討[11]。

有研究報(bào)道，白藜蘆醇抑制腫瘤細(xì)胞的增殖主要表現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成[12-13]，或針對(duì)細(xì)胞周期G1→S和S→G2期，通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期素的影響，上調(diào)或減少細(xì)胞周期依賴激酶等，從而使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯。筆者在本研究中也發(fā)現(xiàn)虎杖中白藜蘆醇作用于肝癌HepG-2細(xì)胞48 h后，可抑制癌細(xì)胞從S期進(jìn)入G2/M期，使G0/G1比例顯著減少，S期比例顯著增多，將細(xì)胞阻滯于S期，通過(guò)抑制DNA的合成，從而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并存在劑量依賴關(guān)系。

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Effects of Resveratrol fromPolygonumCuspidatumon Proliferation and Cell Cycle of HepG-2 Cells

GU Shengjiu, LI Meibo, XU Yourui, ZHU Kaimei

(CollegeofPharmacy,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China)

Objective To investigate effects of resveratrol on the growth and cell cycle of human hepatoblastoma-derived HepG-2 cell line. Methods Resveratrol was extracted by microwave-assisted method and HepG-2 cells were exposed to resveratrol at different concentrations (12.5, 25.0, 50.0, 100.0 μmol·L-1).The viability of HepG-2 cells was measured by MTT.Morphologic changes of the cells were observed under the phase contrast microcope.The cell cycle of HepG-2 cells treated with resveratrol was analyzed by flow cytometry. Results Resveratrol could significantly inhibit proliferation of HepG-2 cells and increase the cells in the S phase in a dose-dependent manner.After 48 h treatment with different concentrations of resveratrol (12.5, 25.0, 50.0 and 100.0 μmol·L-1), the cell proportion of G0/G1phase decreased as compared with control group (P<0.05).The cell proportion of S phase increased in a dose-dependent manner, ranging from (44.82±1.21)%, (54.00±1.71)%, (65.21±3.66)% and (77.50±4.21)%, respectively, in the treatment groups as compared with negative control group[(34.75±3.92)%] (P<0.05). Conclusion Resveratrol can inhibit the proliferation of HepG-2 cells in vitro by inducing cell blockage at S phase.

PolygonumCuspidatum; Resveratrol; HepG-2 cell line; Cell cycle

2014-01-17

2014-07-07

*廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目(桂科合14123001-22，桂科能129825-21)；廣西教育廳科技項(xiàng)目(201202ZD065，2013YB154，2013lX080)；桂林市科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140122-5，20140105-5，20140105-6，20130103-8，20130103-9，20130113-1，2013lX080)。

顧生玖(1965-)，男，甘肅靖遠(yuǎn)人，教授，博士，主要從事心血管病理及藥物防治研究。電話：(0)13607733816，E-mail：gushengjiu@163.com。

朱開梅(1967-)，女，廣西桂林人，教授，碩士，主要從事化學(xué)致病分子機(jī)制和藥物防治研究。電話：(0)18978345717，E-mail：glzkm@163.com。

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1004-0781(2015)02-0162-05