劉 麗， 馬鳴超， 姜 昕， 關(guān)大偉， 杜秉海， 曹鳳明， 李 俊*

(1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018； 2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081； 3農(nóng)業(yè)部微生物產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

根瘤菌與促生菌雙接種對(duì)大豆生長(zhǎng)和土壤酶活的影響

劉 麗1,2， 馬鳴超2,3， 姜 昕2,3， 關(guān)大偉2,3， 杜秉海1， 曹鳳明2,3， 李 俊2,3*

(1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018； 2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081； 3農(nóng)業(yè)部微生物產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

【目的】慢生大豆根瘤菌和膠質(zhì)類芽孢桿菌單一菌株固氮或促生效果及機(jī)理已有較多研究，但兩者雙接種對(duì)作物的作用和增產(chǎn)機(jī)理尚未有所報(bào)道。本研究以慢生大豆根瘤菌5136與膠質(zhì)類芽孢桿菌3016為研究對(duì)象，通過田間小區(qū)試驗(yàn)研究根瘤菌與促生菌不同施用模式對(duì)大豆生長(zhǎng)和土壤酶活的影響，以期為開發(fā)新型高效復(fù)合菌劑提供理論依據(jù)?！痉椒ā吭囼?yàn)設(shè)對(duì)照(T1)、接種膠質(zhì)類芽孢桿菌3016菌劑(T2)、接種慢生大豆根瘤菌5136菌劑(T3)，膠質(zhì)類芽孢桿菌3016和慢生大豆根瘤菌5136雙接種(T4)和常規(guī)施肥(T5)5個(gè)處理，分別于大豆不同生育期調(diào)查大豆的農(nóng)藝性狀和結(jié)瘤狀況，測(cè)定土壤酶活性，用BOX-PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)慢生大豆根瘤菌5136的占瘤率?！窘Y(jié)果】 1)在大豆成熟期，雙接種(T4)處理的大豆單株分枝數(shù)、單株粒數(shù)、收獲指數(shù)和產(chǎn)量均為最高，分別比T1高11.3%、9.7%、41.0%和9.3%，且單株空莢數(shù)最低，比T1降低了44.0%。2)在花莢期，雙接種(T4)處理的占瘤率為25.4%，比T3處理高8.0%，且單株根瘤數(shù)和單株根瘤干重均為最高，分別比T1高41.6%和47.1%；說明雙接種處理下，膠質(zhì)類芽孢桿菌 3016能夠促進(jìn)慢生大豆根瘤菌5136結(jié)瘤固氮。 3)接種微生物菌劑均可不同程度地提高土壤酶活性，以雙接種(T4)處理的效果最為顯著，在大豆成熟期，土壤過氧化氫酶、脲酶和蔗糖酶活性均為最高，分別比對(duì)照高12.9%、8.9%和9.4%。 4)相關(guān)性分析表明，土壤酶活性與大豆收獲指數(shù)顯著正相關(guān)或極顯著正相關(guān)(P<0.01或P<0.05)，其中過氧化氫酶與產(chǎn)量顯著正相關(guān)；單株根瘤數(shù)和單株根瘤干重均與收獲指數(shù)和蔗糖酶活性呈極顯著正相關(guān)，與產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)?！窘Y(jié)論】慢生大豆根瘤菌和膠質(zhì)類芽孢桿菌雙接種可以促進(jìn)大豆生長(zhǎng)，顯著增加大豆的單株分枝數(shù)、單株粒數(shù)、收獲指數(shù)和占瘤率，降低單株空莢數(shù)，增加大豆產(chǎn)量，同時(shí)可顯著提高相關(guān)土壤酶活性，是一種節(jié)本增效的農(nóng)藝措施。

慢生大豆根瘤菌； 膠質(zhì)類芽孢桿菌； 復(fù)合雙接種； 大豆； 占瘤率； 土壤酶活

大豆既是重要的糧食作物，又是重要的油料和蛋白作物，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及社會(huì)經(jīng)濟(jì)生活中占有重要地位。當(dāng)前我國(guó)高達(dá)85%的大豆都依賴進(jìn)口[1]，這嚴(yán)重制約了本土大豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此，提高大豆產(chǎn)量和效益已成為我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)研究的熱點(diǎn)之一。以根瘤菌菌劑為代表的微生物制劑因其具有培肥地力、節(jié)本增效、提高化肥利用率和農(nóng)作物品質(zhì)、降低農(nóng)作物病害等多方面的獨(dú)特作用，已成為發(fā)展綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的不可替代的投入品。

傳統(tǒng)的根瘤菌菌劑往往存在著環(huán)境適應(yīng)性差、占瘤率低和接種效果不穩(wěn)定等問題，制約了其應(yīng)用和發(fā)展。近年來，根瘤菌劑已由單一菌種、單一功能向復(fù)合菌種、多功能方向發(fā)展，將大豆根瘤菌與其它有益微生物復(fù)合，會(huì)更有利于大豆根瘤菌的固氮作用，并已成為大豆根瘤菌劑和其它微生物制劑的研發(fā)方向。植物根際促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria)可通過分泌植物激素、拮抗病原微生物或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等方式促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加作物產(chǎn)量[2-3]。已有研究表明[4]，PGPR菌株與根瘤菌復(fù)合接種，能進(jìn)一步促進(jìn)根瘤菌結(jié)瘤固氮，并通過兩者協(xié)同作用，提高土壤肥力和養(yǎng)分利用率。Elkoca等[5]發(fā)現(xiàn)具有解磷作用的巨大芽孢桿菌M-3與根瘤菌雙接種能夠提高鷹嘴豆的植株生物量、根瘤干重、固氮酶活性和作物產(chǎn)量； Atieno等[6]將枯草芽孢桿菌MIB600分別與2株日本慢生根瘤菌532c和RCR3407混合接種，有效提高了根瘤鮮重和大豆生物量；韓光等[7]通過混合接種巨大芽孢桿菌、聯(lián)合固氮菌和硅酸鹽細(xì)菌，顯著提高了紫花苜蓿瘤質(zhì)量和土壤根瘤菌、固氮菌數(shù)量；Camacho等[8]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌 CECT 450和根瘤菌復(fù)合接種能夠促進(jìn)大豆或豌豆的生長(zhǎng)發(fā)育，刺激根瘤菌的種群數(shù)量及結(jié)瘤。

膠質(zhì)類芽孢桿菌(Paenibacillusmucilaginosus) 3016是本課題組前期分離篩選的1株P(guān)GPR菌株，已研究證實(shí)它能夠溶磷解鉀，產(chǎn)生有機(jī)酸、氨基酸、激素等物質(zhì)，改善植物營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)植株生長(zhǎng)[9-11]。目前，對(duì)膠質(zhì)類芽孢桿菌和大豆根瘤菌單一菌株促生或固氮作用及機(jī)理已有相關(guān)研究[12-14]，但對(duì)兩者雙接種對(duì)大豆的促生效果和增產(chǎn)機(jī)理尚未有所報(bào)道。本研究將以P.mucilaginosus3016與日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)5136為研究對(duì)象，通過田間小區(qū)試驗(yàn)研究根瘤菌與促生菌復(fù)合接種對(duì)大豆生長(zhǎng)、結(jié)瘤狀況和土壤酶活性的影響，旨在為開發(fā)新型高效復(fù)合菌劑提供理論依據(jù)，并為研究不同菌株之間的協(xié)同機(jī)制和菌株與植物的互作機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌種P.mucilaginosus3016、B.japonicum5136均為本實(shí)驗(yàn)室保存；供試大豆品種為魯豆1號(hào)；所用肥料為農(nóng)大復(fù)合肥(N 15.0%、P2O515%、K2O 15%)；培養(yǎng)基成分參照文獻(xiàn)[11]；PCR擴(kuò)增所用的Taq酶、dNTPs等分子生物學(xué)試劑均購(gòu)于大連寶生物有限公司，其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純；BOX-PCR的引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 將P.mucilaginosus3016和B.japonicum5136分別接種到培養(yǎng)基茄子瓶斜面上，30℃分別培養(yǎng)3 d、8 d，使菌體布滿整個(gè)培養(yǎng)平面。刮取表面生長(zhǎng)的菌苔，用無菌水混勻稀釋至適宜濃度，即得菌株發(fā)酵液；稀釋涂布平板法計(jì)算其有效活菌數(shù)。

P.mucilaginosus3016和B.japonicum5136的接種方式均為發(fā)酵液拌種，前者有效活菌數(shù)為3.2×109cfu/mL，每千克種子拌種100 mL；后者有效活菌數(shù)為1.0×1010cfu/mL，每千克種子拌種30 mL。常規(guī)施肥處理施復(fù)合肥，施用量為600 kg/hm2。在大豆整個(gè)生育期內(nèi)，各處理田間管理措施完全相同。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.3.1 大豆農(nóng)藝性狀調(diào)查 根據(jù)大豆的生育特點(diǎn)，分別在花莢期(50 d)、鼓粒期(80 d)每小區(qū)選10株，測(cè)定大豆的株高及葉片葉綠素含量。葉綠素含量用手持葉綠素儀即時(shí)測(cè)定；在大豆成熟期(110 d)測(cè)定株高，并調(diào)查大豆的單株分枝數(shù)、單株莢數(shù)、單株空莢數(shù)、單株粒數(shù)，單株籽粒重和單株生物量及千粒重，每小區(qū)選5株。每個(gè)處理選取代表性的樣點(diǎn)測(cè)定大豆產(chǎn)量。

1.3.2 大豆結(jié)瘤情況調(diào)查和占瘤率測(cè)定

1)大豆結(jié)瘤情況調(diào)查 在花莢期調(diào)查大豆結(jié)瘤情況，具體方法為：用鐵锨在大豆根部將植株完整挖出，盡量避免破壞根瘤，將根系自植株根部節(jié)點(diǎn)剪下，用自來水輕輕沖洗干凈，取下根系所有根瘤，記錄單株根瘤數(shù)并測(cè)單株根瘤干重；采集T3和T4處理的大豆根系樣品做占瘤率測(cè)定，根據(jù)根瘤大小及在主、側(cè)根的分布，選擇新鮮未損傷的代表根瘤，將其連同一小部分根一同剪下，置于裝有50%滅菌甘油的塑料管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)B.japonicum5136占瘤率的測(cè)定

①根瘤菌的分離純化 將根瘤用無菌水沖洗干凈，用95%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞浸泡5 min，無菌水沖洗6次，在平皿中用鑷子擠壓出汁，沾取汁液在YMA平板上三區(qū)劃線，30℃培養(yǎng)直至長(zhǎng)出菌落；采用稀釋涂布和平板劃線法進(jìn)一步純化，鏡檢，挑取單菌落，接入YMA斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

③BOX-PCR BOX-PCR的引物序列為：BOXA1R 5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′，反應(yīng)條件和體系參照文獻(xiàn)[16]，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.3 土壤樣品采集和酶活性測(cè)定 分別在大豆播種前(0 d)、在花莢期(50 d)、鼓粒期(80 d)和成熟期(110 d)用蛇形5點(diǎn)采樣法，采集5—20 cm土樣，用于土壤酶活性的測(cè)定。播種前在小區(qū)內(nèi)隨機(jī)取樣，大豆生育期采集大豆根際土壤樣品。

土壤過氧化氫酶活性的測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法，以1 g干土20 min內(nèi)消耗的0.02 mol/L KMnO4體積數(shù)表示；土壤脲酶活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，結(jié)果以24 h后1 g土壤中NH3-N的mg數(shù)表示；土壤蔗糖酶活性用3,5-二硝基水楊酸比色法，結(jié)果以24 h后1 g干土生成葡萄糖的mg數(shù)表示[17]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel和SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差A(yù)NOVA分析和Duncan新復(fù)極差法分析差異顯著性(P<0.05)；用Quantity One4.6.2軟件對(duì)BOX-PCR結(jié)果進(jìn)行占瘤率分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)大豆生長(zhǎng)的影響

2.1.1 對(duì)株高和葉片葉綠素含量的影響 植株株高和葉片葉綠素是衡量植物在生長(zhǎng)階段是否健壯的重要標(biāo)志之一。從表1可以看出，大豆鼓粒期和成熟期的株高反低于花莢期，原因是隨著大豆的成熟，部分植株莖稈彎曲變形或葉片脫落。在這3個(gè)時(shí)期，雙接種處理(T4)的株高均高于其他處理，T2和T3處理的大豆株高在生育后期亦略優(yōu)于T5，說明菌劑對(duì)大豆的促生作用時(shí)間較長(zhǎng)，可影響整個(gè)生長(zhǎng)期。

大豆葉片葉綠素含量在花莢期和鼓粒期均呈T4>T2、T3、T5>T1的趨勢(shì)，基本與株高的表現(xiàn)相一致，其中花莢期T4處理的葉綠素含量顯著高于其他處理，此時(shí)期是大豆開花并準(zhǔn)備結(jié)莢，從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)的葉綠素含量差異較為明顯。鼓粒期各處理的葉片葉綠素含量差異不顯著，主要是此時(shí)期大豆主要生長(zhǎng)莢果。

表1 不同處理對(duì)不同時(shí)期大豆株高和葉片葉綠素含量的影響

注(Note): 同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異達(dá)5%顯著水平 Values followed by different letters in a column are significant among treatments at the 5% level.

2.1.2 對(duì)大豆成熟期農(nóng)藝性狀的影響 大豆成熟期的單株分枝數(shù)以T4處理最高并顯著高于T1，其他處理間差異不顯著(表2)；單株莢數(shù)以T4和T5處理最多，顯著高于T1和T2；單株空莢數(shù)T4處理最少，比T1降低了44.0%，顯著低于其他處理，說明在本試驗(yàn)條件下T4處理的莢果結(jié)籽效果最好，其他處理差異不顯著；單株粒數(shù)也以T4處理最大，比T1增加9.7%，顯著高于其他處理；T3、T4和T5處理的千粒重差異性不顯著，但均顯著高于T1和T2，說明接種根瘤菌菌劑可提高籽粒的千粒重，且雙接種的效果略好，但與施化肥處理(T5)相差不大。綜合比較成熟期大豆的農(nóng)藝性狀可知，T1處理的大豆植株弱小，單株分枝少，結(jié)莢少且果莢空癟無粒數(shù)較多，使大豆籽粒干癟、量少；雙接種處理(T4)的大豆植株生長(zhǎng)健壯，單株分枝多，結(jié)莢多且果莢籽粒飽滿、量多，表現(xiàn)出顯著的優(yōu)良性狀，說明雙接種對(duì)大豆成熟期農(nóng)藝性狀的改善效果更為顯著。

2.1.3 對(duì)大豆收獲指數(shù)和產(chǎn)量的影響 收獲指數(shù)(Harvest Index, HI, 籽粒重/生物量)反映作物群體光合同化物轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品的能力，是評(píng)價(jià)作物品種產(chǎn)量水平和栽培成效的重要指標(biāo)。收獲指數(shù)有著較高的遺傳力，同時(shí)也受到環(huán)境條件的制約。由不同處理大豆的收獲指數(shù)和產(chǎn)量(表3)，可以看出，T4處理的收獲指數(shù)高達(dá)0.55，顯著高于其他處理；T2處理顯著高于T1和T5，T3顯著高于T1，說明接種菌劑均有利于收獲指數(shù)的提高，且以雙接種處理效果更好。T4處理大豆的增產(chǎn)效果最為明顯，產(chǎn)量顯著高于T1和T2；T3處理的產(chǎn)量略高于常規(guī)施肥(T5)，但顯著高于對(duì)照(T1)。雙接種處理的大豆產(chǎn)量可達(dá)2391.36 kg/hm2，增產(chǎn)率9.3%。

表2 大豆成熟期的農(nóng)藝性狀

注(Note): 同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異達(dá)5%顯著水平 Values followed by different letters in a column are significant among treatments at the 5% level.

表3 不同處理大豆的收獲指數(shù)和產(chǎn)量

注(Note): 同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異達(dá)5%顯著水平 Values followed by different letters in a column are significant among treatment at the 5% level.

2.2 不同處理對(duì)大豆結(jié)瘤和占瘤率的影響

2.2.1 大豆的結(jié)瘤狀況 花莢期是大豆生育最旺盛的時(shí)期，此時(shí)大豆結(jié)瘤固氮往往達(dá)到最高峰，調(diào)查該時(shí)期的大豆結(jié)瘤情況并加以比較，可以分析大豆生長(zhǎng)前期共生固氮的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)狀況。由表4可知，雙接種(T4)處理的單株根瘤數(shù)和單株根瘤干重均顯著高于其他處理，比根瘤菌單接種(T3)處理分別高24.5%和25.0%，同時(shí)，T2處理顯著高于T1和T5處理，說明促生菌P.mucilaginosus能夠有效促進(jìn)B.japonicum在大豆根部結(jié)瘤。

表4 大豆花莢期結(jié)瘤情況調(diào)查表

注(Note): 同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異達(dá)5%顯著水平 Values followed by different letters in a column are significant among treatments at the 5% level.

圖1 部分菌株的BOX-PCR電泳圖譜Fig.1 BOX-PCR fingerprinting of tested strains[注(Note)： M為2-log DNA Ladder represents 2-log DNA Ladder.]

2.3 不同處理對(duì)土壤酶活性的影響

2.3.1 過氧化氫酶活性 土壤過氧化氫酶活性與好氧微生物數(shù)量和土壤肥力密切相關(guān)。從圖2可以看出，過氧化氫酶活性基本呈現(xiàn)花莢期先降低，鼓粒期后升高，成熟期再降低的趨勢(shì)，在大豆不同生育時(shí)期各處理表現(xiàn)不同。播種前各處理的過氧化氫酶活性基本一致；花莢期T3處理的過氧化氫酶活性最高，顯著高于對(duì)照處理(T1)，其他處理間差異不顯著；鼓粒期T3和T4 2個(gè)處理的過氧化氫酶活性顯著高于其他處理，分別比對(duì)照高8.1%和7.1%；成熟期呈現(xiàn)出T4>T2>T3>T5>T1的趨勢(shì)，雙接種的T4處理最高，比對(duì)照增加13.0%。單接種T2和T3處理的過氧化氫酶活性也顯著高于對(duì)照(T1)和常規(guī)施肥(T5)?？梢?，接種P.mucilaginosus和B.japonicum均可有效提高土壤過氧化氫酶活性，其中以雙接種效果最為顯著。

圖2 不同處理對(duì)不同時(shí)期土壤過氧化氫酶活性的影響Fig.2 Effects of different treatments on catalase activity at different stages[注(Note)： 柱上不同字母表示處理間差異達(dá)5% Different letters above the bars mean significant among treatments at the 5% level.]

2.3.2 脲酶活性 由圖3可知，各處理脲酶活性整體變化幅度較大，在大豆生育期內(nèi)降低，可能由于大豆植株本身與根瘤菌共生固氮所致。花莢期各處理脲酶活性明顯低于播種前，但2個(gè)時(shí)期內(nèi)各處理間差異不顯著；鼓粒期的脲酶活性T2和T4處理顯著高于其他處理，以雙接種T4處理最高，但與單接種T2差異不顯著；成熟期T4處理的脲酶活性最高，優(yōu)于單接種處理T2和T3，且顯著高于對(duì)照(T1)和常規(guī)施肥(T5)。大豆各生育期，常規(guī)施肥(T5)的脲酶活性均低于其他處理，可能是由于化學(xué)肥料對(duì)微生物數(shù)量和活性的影響所致。

圖3 不同處理對(duì)不同時(shí)期土壤脲酶活性的影響Fig.3 Effects of different treatments on urease activity at different stages [注(Note)： 柱上不同字母表示處理間差異達(dá)5% Different letters above the bars mean significant among treatments at the 5% level.]

2.3.3 蔗糖酶活性 大豆整個(gè)生育期的土壤蔗糖酶活性總體變化不大(圖4)，但各時(shí)期不同處理間存在一定的差異?；ㄇv期T2、T3和T4處理的蔗糖酶活性顯著高于T1和T5；鼓粒期T3和T4處理顯著高于T1、T2和T5，以雙接種T4處理的土壤蔗糖酶活性最高；成熟期T4處理蔗糖酶活性可達(dá)1.84 Glucaose mg/(g·24h)，比對(duì)照(T1)增加10%，并顯著高于其他處理。由此可見，接種P.mucilaginosus和B.japonicum均有利于土壤蔗糖酶活性的提高，以雙接種效果更為顯著。

圖4 不同處理對(duì)不同時(shí)期土壤蔗糖酶活性的影響Fig.4 Effects of different treatments on invertase activity at different stages [注(Note)： 柱上不同字母表示處理間差異達(dá)5% Different letters above the bars mean significant among treatments at the 5% level.]

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1 大豆農(nóng)藝性狀與土壤酶活性的相關(guān)分析 對(duì)成熟期大豆的農(nóng)藝性狀和土壤酶活性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果(表5)發(fā)現(xiàn)，單株空莢數(shù)與土壤過氧化氫酶 (r=-0.583*，P<0.05)和脲酶(r=-0.554*，P<0.05) 呈顯著負(fù)相關(guān)。其他性狀與土壤酶活之間均呈現(xiàn)正相關(guān)，其中，收獲指數(shù)、單株粒數(shù)與酶活間的相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到顯著或極顯著 (P<0.05或P<0.01)水平；其次為單株分枝數(shù)和單株空莢數(shù)，與2種酶活性的相關(guān)性達(dá)到顯著水平；產(chǎn)量與過氧化氫酶活性相關(guān)性顯著(r=-0.542*，P<0.05)；單株莢數(shù)和千粒重與土壤酶活性的相關(guān)性不顯著。綜上結(jié)果可見，土壤酶活性主要影響大豆的分枝、結(jié)莢及籽粒收獲成熟等指標(biāo)，對(duì)大豆的生長(zhǎng)起到重要作用。

表5 大豆農(nóng)藝性狀與土壤酶活之間的相關(guān)性(r)

注(Note): *—P<0.05; **—P<0.01.

2.4.2 結(jié)瘤情況與土壤酶活性的相關(guān)性分析 由表6可知，土壤酶活性與大豆單株根瘤數(shù)和單株跟瘤干重均呈正相關(guān)。其中蔗糖酶與單株根瘤數(shù)(r=0.70**，P<0.01)、單株根瘤干重(r=0.701**，P<0.01)之間呈極顯著正相關(guān)，說明蔗糖酶活性可能是影響結(jié)瘤和根瘤質(zhì)量的一個(gè)重要的因子。

表6 大豆結(jié)瘤情況與土壤酶活性之間的相關(guān)性(r)

注(Note): NDW —Nodule dry weight. *—P<0.05; **—P<0.01.

2.4.3 大豆性狀與結(jié)瘤情況的相關(guān)性分析 大豆-根瘤菌的共生體系可為植株提供氮素營(yíng)養(yǎng)，對(duì)大豆的農(nóng)藝性狀與結(jié)瘤情況進(jìn)行相關(guān)性分析，有利于了解根瘤對(duì)大豆植株的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)貢獻(xiàn)率。由表7可知，單株根瘤數(shù)和單株根瘤干重與大豆性狀間的相關(guān)性表現(xiàn)一致，兩項(xiàng)結(jié)瘤指標(biāo)均與大豆單株空莢數(shù)、單株粒數(shù)和收獲指數(shù)呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，與單株分枝數(shù)和產(chǎn)量呈顯著相關(guān)(P<0.05)，與單株空莢和千粒重相關(guān)性不顯著，可見，根瘤的數(shù)量和質(zhì)量是影響大豆生理性狀的一個(gè)重要因素，與大豆分枝、結(jié)莢、產(chǎn)量和收獲指數(shù)等密切相關(guān)。

3 討論

P.mucilaginosus和B.japonicum憑借良好的溶磷、解鉀及固氮功能在微生物肥料中備受關(guān)注[18]。P.mucilaginosus能夠釋放出土壤中的難溶性鉀，改善植物營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)條件，并通過產(chǎn)生有機(jī)酸、氨基酸、激素等物質(zhì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，還可產(chǎn)生胞外多糖等物質(zhì)增強(qiáng)植物非特異性免疫能力，有些菌株還具備溶磷和固氮功能[19-20]。B.japonicum是一種較早被人類應(yīng)用和研究的固氮微生物，可通過與豆科作物共生結(jié)瘤，從而為宿主提供氮素，提高土壤肥力，增加作物產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)[21]。目前，關(guān)于這2種細(xì)菌單一接種對(duì)作物的促生效果的研究相對(duì)較多，孟慶英等[22]施用B.japonicum增加了大豆的株高、主攀節(jié)數(shù)、單株莢數(shù)和單株粒數(shù)，并有效增加大豆產(chǎn)量；吳洪生等[23]施用P.mucilaginosus增加了花生有效根瘤、單株結(jié)莢數(shù)、百果重和出仁率，實(shí)現(xiàn)花生增產(chǎn)17.93%。本研究采用拌種方式，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了P.mucilaginosus和B.japonicum雙接種對(duì)大豆的結(jié)瘤固氮和促生的復(fù)合效果。雙接種不僅能提高大豆的株高，而且增加大豆單株分枝數(shù)、單株莢數(shù)，降低單株空莢數(shù)，提高單株粒數(shù)和千粒重，從而顯著提高收獲指數(shù)和大豆產(chǎn)量，使大豆增產(chǎn)9.3%，明顯優(yōu)于常規(guī)施肥處理。接種P.mucilaginosus和B.japonicum可促進(jìn)花莢期和鼓粒期大豆葉片葉綠素的合成，這兩個(gè)時(shí)期既是大豆光合作用最強(qiáng)也是生長(zhǎng)發(fā)育的重要時(shí)期，無論是單接種還是雙接種，其作用均好于常規(guī)施肥，這也在一定程度上體現(xiàn)了P.mucilaginosus和B.japonicum對(duì)大豆的增效作用。另外，雙接種還能促進(jìn)大豆結(jié)瘤，使B.japonicum5136的占瘤率提高了8.0%，這與前人的研究結(jié)果一致[4]。

表7 大豆性狀與結(jié)瘤之間的相關(guān)性(r)

注(Note): NDW—Nodule dry weight. *—P<0.05; **—P<0.01.

土壤酶是一類存在于土壤中具有催化能力的生物活性物質(zhì)，參與生物化學(xué)過程和養(yǎng)分循環(huán)，影響土壤中碳的轉(zhuǎn)化、循環(huán)和微生物豐度，是影響土壤微生態(tài)環(huán)境的重要因素，也是反映土壤肥力的一個(gè)重要指標(biāo)[15,24]。土壤酶主要通過不同微生物類群的生理代謝產(chǎn)生，能夠表征相應(yīng)功能微生物的存在和活性[25]，研究土壤各種酶活性的變化可對(duì)研究環(huán)境變化時(shí)微生物的響應(yīng)機(jī)制提供新的思路[26]。其中，過氧化氫酶是參與土壤中物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化的一種重要氧化還原酶，可促進(jìn)H2O2分解為水和氧氣，降低對(duì)生物體和土壤的毒害作用，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一，其活性與土壤呼吸作用及土壤微生物活動(dòng)密切相關(guān)[27]。脲酶主要來源于植物和微生物，是一種專性水解尿素的酰胺酶，其活性通常與土壤微生物數(shù)量、有機(jī)質(zhì)含量、全氮和速效磷含量呈正相關(guān)，可在一定水平上反映土壤的供氮水平與能力[28]。蔗糖酶參與碳水化合物的轉(zhuǎn)化，是一種能使高分子量的蔗糖分解成葡萄糖和果糖的水解酶，可為植物和微生物提供充分的能源，其活性可反應(yīng)土壤有機(jī)碳積累與轉(zhuǎn)化規(guī)律[29]。試驗(yàn)結(jié)果表明，接種P.mucilaginosus和B.japonicum后，土壤酶活性有所提升，其作用可影響大豆整個(gè)生長(zhǎng)期，這可能是由于接種的細(xì)菌改善了土壤的微環(huán)境，一定程度上激活了土壤中有益的土著微生物，使其胞外酶釋放含量增多[30]。其中，雙接種與單接種和常規(guī)施肥相比效果更為顯著，特別是鼓粒期和成熟期，這說明兩種細(xì)菌可能直接通過某種互作機(jī)制進(jìn)一步發(fā)揮作用，也可能是由于PGPR能夠促進(jìn)大豆根系的生長(zhǎng)發(fā)育，結(jié)合B.japonicum與大豆植株的共生固氮效果，使發(fā)達(dá)的根系產(chǎn)生更豐富的根系分泌物，從而更有利于土壤酶活性的提高。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大豆生長(zhǎng)前期雙接種處理的土壤酶活性與其他處理并不顯著，這可能是由于作物生長(zhǎng)前期施用化肥的效果更快，抵消了有益微生物的作用。

有關(guān)土壤酶活性與其他指標(biāo)的相關(guān)性方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)玉米、小麥等作物已有較多研究，如杜廣紅等[31]發(fā)現(xiàn)不同施肥處理下，土壤脲酶和纖維素酶與玉米和小麥的產(chǎn)量均呈顯著正相關(guān)，說明土壤酶活性可在一定程度上促進(jìn)作物對(duì)養(yǎng)分的吸收進(jìn)而反映土壤肥力狀況；而Dick等[32]通過小麥-休耕體系的長(zhǎng)期定位試驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)土壤脲酶、磷酸酶活性等與有機(jī)碳和全氮顯著正相關(guān)，但與產(chǎn)量沒有顯著關(guān)系，推測(cè)土壤酶活性因受pH等多種因素的影響，只是土壤肥力的部分反映。目前，關(guān)于根瘤菌與PGPR不同施用方式下土壤酶活性與大豆農(nóng)藝性狀和結(jié)瘤的相關(guān)性的報(bào)道還相對(duì)較少。實(shí)際上，大豆農(nóng)藝性狀、占瘤率和土壤酶活性各部分并不是孤立的，從系統(tǒng)的整體看，三者之間具有復(fù)雜的聯(lián)系，因此本研究從上述三方面進(jìn)行了相關(guān)性分析，以期為進(jìn)一步解釋內(nèi)在的深層機(jī)制提供參考。結(jié)果表明，過氧化氫酶與單株粒數(shù)和收獲指數(shù)呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，與單株分枝數(shù)、單株空莢數(shù)和產(chǎn)量顯著相關(guān)(P<0.05)。脲酶與單株空莢數(shù)和收獲指數(shù)呈顯著相關(guān)。蔗糖酶與收獲指數(shù)極顯著相關(guān)，與單株分枝數(shù)和單株粒數(shù)顯著相關(guān)。可見，土壤酶活性主要影響到大豆分枝、結(jié)莢及籽粒收獲成熟等指標(biāo)，對(duì)大豆的生長(zhǎng)發(fā)育起到重要作用，這與杜廣紅等[31]的研究結(jié)果相似；蔗糖酶與單株根瘤數(shù)和單株根瘤干重之間呈極顯著正相關(guān)，說明蔗糖酶可影響結(jié)瘤和根瘤質(zhì)量，這可能與蔗糖酶催化產(chǎn)生的葡萄糖和果糖可為根瘤的形成提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)；單株根瘤數(shù)和單株根瘤干重兩個(gè)結(jié)瘤因子與大豆農(nóng)藝性狀的相關(guān)性基本一致，均與大豆單株空莢數(shù)、單株粒數(shù)和收獲指數(shù)呈極顯著相關(guān)，與單株分枝數(shù)和產(chǎn)量呈顯著相關(guān)，說明結(jié)瘤可影響大豆分枝、結(jié)莢、產(chǎn)粒和收獲，結(jié)瘤的數(shù)量和質(zhì)量是影響大豆生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要因子，這可能是由于根瘤的固氮作用所致。綜上可知，土壤酶活性、大豆農(nóng)藝性狀和結(jié)瘤情況之間相互作用、密切相關(guān)，其具體機(jī)理還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

P.mucilaginosus3016和B.japonicum5136 均對(duì)大豆有一定的促生增效作用，而兩者雙接種具有增進(jìn)大豆結(jié)瘤固氮和促生的復(fù)合功效，且能夠顯著改善土壤過氧化氫酶、脲酶和蔗糖酶活性，提高植株株高、葉綠素、單株分枝、單株粒數(shù)、單株莢數(shù)、千粒重等農(nóng)藝性狀，增加占瘤率和有效根瘤的數(shù)量；雙接種比對(duì)照增產(chǎn)9.3%，大豆產(chǎn)量可達(dá)2391.36 kg/hm2，是節(jié)本增效的有效措施。本研究結(jié)果對(duì)微生物肥料的菌種組合及其生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。

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Effect ofRhizobiaand PGPR co-inoculant on soybean characteristics and soil enzyme activities

LIU Li1,2， MA Ming-chao2,3， JIANG Xin2,3， GUAN Da-wei2,3， DU Bing-hai2,3， CAO Feng-ming2,3， LI Jun2,3*

(1CollegeofLifeScience,ShandongAgriculturalUniversity/ShandongProvinceKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,Tai’an,Shandong271018,China; 2InstituteofAgriculturalResourcesandRegionalPlanning,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China; 3LaboratoryofQuality&SafetyRiskAssessmentforMicrobialProducts,MinistryofAgriculture,Beijing100081,China)

【Objectives】 The effects and mechanism on single inoculant ofPaenibacillusmucilaginosusandBradyrhizobiumjaponicumhave been widely characterized, but few on the that of co-inoculant of them. A field experiment was carried out to reveal the effects of rhizobia and PGPR on soil enzyme activities, soybean growth and nodulation. 【Methods】 Five differents with fertilization measures in this field experiment were designed by T1(CK), T2(inoculant ofPaenibacillusmucilaginosus3016), T3(inoculant ofBradyrhizobiumjaponicum5136), T4(co-inoculant ofP.mucilaginosus3016 andB.japonicum5136) and T5(the regular fertilizer dose). Soil enzyme activities, soybean growth characteristics at different stages of soybean and the nodule occupancy ofB.japonicum5136 were studied. BOX-PCR was used to analyze the nodule occupancy ofB.japonicum5136.【Results】 1) At maturation periods, soybean growth traits, branch number per plant, seeds per plant, harvest index and yield in the T4 treatment were the highest, and respectively increased by 11.3%, 9.7%, 41.0% and 9.3% relative to those in the T1 treatment. The empty pods per plant in T4 treatment was the lowest, and was 44.0% lower than that in the T1 treatment, indicating the prosperous effect of co-inoculant on improving soybean traits. 2) The nodule occupancy ofB.japonicum5136 in the T4 treatment was 25.4%, and 8.0% higher than T3 treatment. Nodules per plant, nodule dry matter per plant in the T4 treatment exhibited the highest values during the flowering and podding periods, and increased 41.6% and 47.1% relative to thosed in the T1 treatment, suggesting thatP.mucilaginosus3016 was helpful to nodulation ofB.japonicum5136. 3)P.mucilaginosus3016 andB.japonicum5136 could increase the activities of catalase, urease and invertase in soil. During maturation periods,the activity of these enzymes in T4 treatment was the highest, and were 12.9%, 8.9% and 9.4% higher than T1 treatment, respectively. 4)The soil enzyme activities were significantly and positive correlated(P<0.01) or positive correlated(P<0.05) with harvest index, and catalase activity was positive correlated with yield. Nodules per plant and nodule dry matter per plant were significantly positive correlated with harvest index and invertase activity, respectively, and was positive correlated with yield. 【Conclusions】 Co-inoculant ofP.mucilaginosus3016 andB.japonicum5136 could significantly increase soybean branch number per plant, seeds per plant, harvest index, the yield and nodule occupancy, and reduce the empty pods per plant, and increase enzyme activities, indicating that the co-inoculant ofP.mucilaginosus3016 andB.japonicum5136 is an optimal application measure in soybean cropping system.

Bradyrhizobiumjaponicum;Paenibacillusmucilaginosus; co-inoculant, soybean; nodule occupancy; soil enzyme activity

2014-01-17 接受日期: 2014-06-17 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-02-12

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31200388)；國(guó)家863計(jì)劃(2013AA102802-04)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)支持項(xiàng)目(CARS-04)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2013-1)資助。

劉麗(1989—)，女，山東臨沂人，碩士，主要從事微生物生態(tài)方面的研究。E-mail: liuli__abc@163.com * 通信作者 E-mail: li@caas.ac.cn

S144.3； S565.1.01

A

1008-505X(2015)03-0644-11