濕疹納米乳中丹皮酚包封率的測定

顏學(xué)軍，陳光宇，鐘 鳴，謝名君，康店如，何 群，2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南省藥學(xué)“十二五”重點(diǎn)學(xué)科，湖南 長沙 410208）

濕疹納米乳中丹皮酚包封率的測定

顏學(xué)軍1，陳光宇1，鐘 鳴1，謝名君1，康店如1，何 群1，2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南省藥學(xué)“十二五”重點(diǎn)學(xué)科，湖南 長沙 410208）

目的 建立濕疹納米乳中丹皮酚的包封率測定方法，用于評價(jià)濕疹納米乳制備工藝。方法 采用葡聚糖凝膠G-50柱分離濕疹納米乳中包封的丹皮酚與未包封的丹皮酚。HPLC法測定濕疹納米乳中丹皮酚的含量，并計(jì)算其包封率。結(jié)果 納米乳中丹皮酚的含量在0.4160～41.60 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r為0.999 9，加樣回收率平均值為98.43%，RSD為2.90%；納米乳中丹皮酚的包封率值為 （92.43±0.44）%，RSD為0.43%（n=6），葡聚糖凝膠柱分離納米乳上樣回收率為 （90.5± 0.17）%，RSD為1.84%。結(jié)論 葡聚糖凝膠G-50可以將濕疹納米乳和游離的丹皮酚較好地分開，濕疹納米乳中丹皮酚的包封率測定方法可作為工藝研究的評價(jià)方法。

濕疹納米乳；包封率；上樣回收率；丹皮酚；葡聚糖凝膠G-50；徐長卿

濕疹納米乳處方來源于湖南中醫(yī)藥大學(xué)皮膚科專家楊志波教授創(chuàng)制的治療慢性濕疹的外用經(jīng)驗(yàn)方，由徐長卿、苦參、黃柏等中藥材提取的有效成分組成，前期藥效及臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，該制劑具有止癢、抗菌、免疫抑制、抗炎作用，用于治療慢性濕疹，療效確切，無毒副作用。其中君藥徐長卿提取的有效成分為丹皮酚，由于濕疹納米乳工藝研究中需采用丹皮酚包封率作為評價(jià)指標(biāo)，因此，本研究采用HPLC法測定丹皮酚含量，通過制備葡聚糖凝膠G-50分離濕疹納米乳中包封的丹皮酚與游離的丹皮酚的流出曲線，研究濕疹納米乳中丹皮酚包封率的測定方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent-1200高效液相色譜系統(tǒng)(美國安捷倫公司；包括G1311A四元梯度泵，G1313A標(biāo)準(zhǔn)型自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1314A紫外檢測器，Agilent Chemstation色譜工作站)；AR124CN型電子天平(奧豪斯儀器有限公司）；SK3300H型超聲波清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥及材料

丹皮酚對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號110708-200506，純度≥99.68%）；葡聚糖凝膠G-50（粒徑:50～150 μm，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；濕疹納米乳（自制）；色譜級甲醇（Tedia公司，批號CAS-67-56-1），分析級甲醇(成都市科龍化工試劑廠，批號20140214011）；重蒸餾水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 濕疹納米乳制備

稱取徐長卿藥材提取物丹皮酚0.3 g、助乳化劑1.1 g、油相1.4 g、乳化劑4.6 g，混合攪拌使溶解，加蒸餾水15 mL攪拌使其溶解。將水相緩慢滴加至油相中，邊加邊攪拌，得到無色的澄清液體，即含藥納米乳。含藥濕疹納米乳中丹皮酚含量為8.919 mg/g，含藥內(nèi)相總體積為33 mL。同法制備缺徐長卿藥材提取物的空白濕疹納米乳。濕疹納米乳三元相圖見圖1。

圖1 濕疹納米乳三元相圖

2.2 濕疹納米乳中丹皮酚含量測定方法的建立[1]

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱為Ultimate XB-C18-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（45∶55），檢測波長為274 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 取丹皮酚對照品約0.01 g，精密稱定，加5 mL甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，再加甲醇定容至刻度線，搖勻，精密吸取1 mL對照品溶液至25 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，即得每mL含41.6 μg的丹皮酚對照品溶液。

2.2.3 丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別取上述丹皮酚對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1、2、10 mL，分別加甲醇稀釋并定容至10 mL，搖勻，取適量用0.45 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣量 20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測峰面積，以峰面積A為縱坐標(biāo)、丹皮酚濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為:

即丹皮酚在0.416～41.6 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 供試品溶液的制備 精密吸取濕疹納米乳樣品1 mL，置于錐形瓶中，加入50 mL甲醇，搖勻，精密吸取1 mL溶液，加甲醇定容至5 mL，取適量用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.5 陰性對照品溶液的制備 精密吸取缺徐長卿藥材提取物的濕疹納米乳樣品1 mL，同“2.2.4”項(xiàng)下方法制成陰性對照品溶液。

2.2.6 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對照品溶液、陰性對照品溶液、供試品溶液各20 μL，進(jìn)樣進(jìn)行分析，色譜圖見圖2、圖3。

圖2 丹皮酚對照品HPLC圖

圖3 濕疹納米乳供試品HPLC圖

由圖2、圖3、圖4結(jié)果可知，供試品與對照品中丹皮酚峰在同一位置，陰性樣品色譜在同一位置上無干擾，符合定量分析要求，可用于工藝研究。

2.2.7 濕疹納米乳中丹皮酚含量測定方法學(xué)考察試驗(yàn)結(jié)果 精密試驗(yàn)結(jié)果RSD為0.99%(n=6)，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，丹皮酚含量平均值為8.919 mg/g，RSD為1.77%(n=6)，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果可知，從0到36小時(shí)各點(diǎn)的變異，即RSD為1.02%，表明36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，數(shù)據(jù)間的差異屬取點(diǎn)誤差，而非穩(wěn)定性變化引起的。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，丹皮酚含量平均值為98.43%，RSD為2.90%（n=9），符合定量分析的規(guī)定，可用于濕疹納米乳中丹皮酚含量測定。

2.3 納米乳洗脫曲線的制備[2-4]

稱取葡聚糖凝膠G-50 1.1 g于200 mL蒸餾水溶脹24 h，濕法裝柱（內(nèi)徑1.0 cm，柱長45 cm），精密吸取0.2 mL濕疹納米乳上樣，用蒸餾水洗脫，流速0.6 mL/min，收集洗脫液，每3 mL 1管，共收集20管，將每管洗脫液轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻后再吸取1 mL溶液至5 mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻后，用0.45 μm微孔濾膜過濾，在274 nm處按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定丹皮酚峰面積積分值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，丹皮酚峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖4。

圖4 濕疹納米乳洗脫曲線

從圖4中濕疹納米乳洗脫曲線可知，納米乳通過葡聚糖凝膠柱后，納米乳與游離丹皮酚分離，前12管系納米乳流出曲線，13管以后為游離丹皮酚流出曲線，因?yàn)槠暇厶悄z分離系分子篩效應(yīng)，即大分子（納米乳）先被洗脫流出，小分子（游離丹皮酚）后被洗脫流出。

2.4 葡聚糖凝膠G-50前處理、上樣及洗脫液樣品處理

2.4.1 葡聚糖凝膠G-50的處理及上樣實(shí)驗(yàn)方法 稱取葡聚糖凝膠G-50 1.1 g，溶脹24 h，裝柱及上樣法同“2.3”項(xiàng)，蒸餾水洗脫，依照納米乳洗脫曲線，先收集 12管前的 36 mL洗脫液，再收集 13管后的24 mL洗脫液。分別從收集的兩部分洗脫液中精密吸取5mL洗脫液，置于10 mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度線，搖勻，0.45 μm的微孔濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定兩部分洗脫液中丹皮酚含量。

2.4.2 濕疹納米乳樣品中丹皮酚投料量的測定精密吸取濕疹納米乳1.0 mL置于10 mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻后再精密吸取0.5 mL的溶液，置于25 mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm的微孔濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，供高效液相測定。

2.4.3 包封率計(jì)算 根據(jù)丹皮酚峰面積積分值，代入丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出丹皮酚進(jìn)樣濃度，再按下式計(jì)算納米乳包封率及上樣回收率[5-6]，見表1。

表1 包封率測定及計(jì)算結(jié)果

將表1中數(shù)據(jù)代入納米乳包封率計(jì)算公式中，得包封率為92.41%，上樣回收率為91.80%，其結(jié)果符合2010版《中華人民共和國藥典》包封率不得小于80%有關(guān)規(guī)定。

按上述包封率測定方法，測定6批濕疹納米乳樣品中丹皮酚包封率均值為（92.43%±0.44）%，上樣回收率為 （90.50±0.17）%包封率及上樣回收率＞80%，RSD＜2%，可作為濕疹納米乳制備工藝方法及工藝條件優(yōu)化研究的評價(jià)指標(biāo)。

3 討論

3.1 葡聚糖凝膠類型的選擇

目前常用的葡聚糖凝膠類型有G-50與G-25，預(yù)試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在濕疹納米乳丹皮酚的洗脫曲線制備中，G-25與G-50的流出曲線基本相同，兩者分離效果皆較理想，但是G-25的吸水能力差，所以用量大，載藥量小，因此本實(shí)驗(yàn)選用葡聚糖凝膠G-50作為分離納米乳中被包封丹皮酚納米乳和游離丹皮酚的載體。

3.2 上樣量及洗脫劑的選擇

上樣量與測定方法和層析柱的大小有關(guān)，如果檢測方法靈敏度高或者柱床體積小，上樣量可小，否則上樣量需加大。一般來說，樣品的上樣量最好控制在柱床體積的1%～5%之間，最多不要超過10%，樣品體積過大，分離效果不好。為了達(dá)到較好的分離效果本實(shí)驗(yàn)上樣量0.20 mL，占柱體積的1.61%。層析柱一般用單一緩沖溶液或鹽溶液作為洗脫液，有時(shí)甚至用蒸餾水作為洗脫劑。為了保持納米乳在洗脫過程中的形態(tài)，避免洗脫劑的影響導(dǎo)致納米乳在洗脫過程中破乳，從而影響分離效果，所以本實(shí)驗(yàn)經(jīng)反復(fù)摸索，確定用重蒸餾水作為洗脫劑較合適。

3.3 測定上樣回收率的意義

上樣回收率也稱為柱回收率，主要考察納米乳通過葡聚糖凝膠到流出在整個(gè)上樣、分離、洗脫過程中的損失，一般要求上樣回收率不低于90%。

[1]陳光宇，毛驍麗，何群，等.HPLC測定濕疹納米乳噴霧劑中丹皮

酚的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(24):98-100.

[2]鄭穩(wěn)生，方夏琴，張宇佳，等.多柔比星前體脂質(zhì)體包封率測定及影響因素考察[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31(11):1 497-1 499.

[3]陳大兵，張 強(qiáng).紫杉醇表面修飾脂質(zhì)納米粒的制備和性質(zhì)[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào):（醫(yī)學(xué)版），2002，34(1):57-60.

[4]宋金春，黃 嶺，陳佳麗.羥基喜樹堿脂質(zhì)體的制備及其包封率測定[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27(10):1 381-1 383.

[5]姜 展，劉 新，張桂平，等.復(fù)方辣椒堿納米乳中辣椒堿包封率的測定方法研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，26(2):195-197.

[6]趙菊香，程 怡，吳 瓊，等.苦參素空間穩(wěn)定脂質(zhì)體的包封率測定和體外釋放度考察[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(3):4-7.

（本文編輯 蘇 維）

Determination of Encapsulation Efficiency of Paeonol in Eczema Nanoemulsion

Xue-Jun Yan1,Guang-Yu Chen1,Ming Zhong1,Ming-Jun Xie1,Ding-Ru Kang1,Qun He1,2*
(1.School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;
2.Key Discipline of"Twelfth Five-Year"Pharmacy Plan in Hunan,Changsha 410208,Hunan China)

Objective To establish an encapsulation efficiency determination method of paeonol in eczema nanoemulsion for evaluating the preparation process of eczema nanoemulsion.Methods The paeonol of encapsulated and unencapsulated in eczema nanoemulsion was separated by Sephadex G-50 gel column,the concentration of Paeonol in the eczema nanoemulsion was detected by HPLC，then the encapsulation efficiency and column recovery rate of paeonol were calculated.Results The concentration of paeonol in nanoemulsion showed a fine linear relationship at 0.4160～41.60 μg/mL,with r values of 0.999 9, average recovery was 98.43%,with RSD of 2.90%.The average of encapsulatio efficiency was(92.43±0.44)%,with RSD of 0.43%.The column recovery rate was(90.50±0.17)%,with RSD of 1.84%.Conclusion Free Paeonol and eczema nanoemulsion can be separated perfectly by Sephadex G-50 column;the determination method of encapsulation efficiency of paeonol in eczema nanoemulsion can be used as evaluation index of processes study.

eczema nanoemulsion;encapsulation efficiency;column recovery rate;paeonol;Sephadex G-50;Cynanchum paniculatum

R283.6

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.08.010

2015-04-16

國家科技部支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目（2008BAI53B042）。

顏學(xué)軍，男，在讀碩士研究生，研究方向:中藥外用制劑、中藥劑型與療效的研究。

*何 群，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:hequn88＠126.com。