廖烈君 尹利君 曾麒燕

(廣西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，廣西 南寧 530021)

論 著

兩種用FITC標記紅桂木凝集素方法的比較*

廖烈君 尹利君 曾麒燕△

(廣西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，廣西 南寧 530021)

目的：紅桂木凝集素(Artocarpus lingnanensis lectin，ALL)與異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)方法的探究。方法：分別采用透析法和固化法使FITC與紅桂木凝集素偶聯(lián)，檢測偶聯(lián)物的F/P值。結(jié)果：固相化法的F/P值達1.02，其它方法F/P值約為0.758。結(jié)論：采用固化法使FITC標記紅桂木凝集素，實驗重復性較好，方法穩(wěn)定可靠，且可獲得較高偶聯(lián)率的紅桂木凝集素偶聯(lián)異硫氰酸熒光素(ALL-FITC)利于后續(xù)實驗研究。

FITC；凝集素；透析；濃縮

凝集素是一類能與糖類特異性結(jié)合并能使細胞凝集的蛋白質(zhì)或糖蛋白[1-2]。它能與糖專一地、非共價地可逆結(jié)合，并具有凝集細胞和沉淀聚糖或糖復合物的作用，而細胞表面糖鏈物在細胞癌變、浸潤和轉(zhuǎn)移中都起著重要作用[3-4]。因此近年來，凝集素漸漸成為研究細胞生物膜表面性質(zhì)變化的重要探針。為更好的開展紅桂木凝集素(Artocarpus lingnanensis lectin，ALL)作為分子探針的研究和進一步研究紅桂木凝集素受體在腫瘤細胞上的分布情況，需要建立用熒光素標記紅桂木凝集素的方法。凝集素與異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)結(jié)合的方法文獻報道中主要有透析法和固化法，且結(jié)合物的F/P值有較大的不同[5]。目前還未有FITC標記ALL的相關(guān)報道，本實驗將對透析法和固化法用FITC標記紅桂木凝集素的效果進行探索研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

純化的ALL，為本課題組制備；FITC(F7250，美國Sigma公司)；透析袋(分子量10000)(美國Sigma公司)；半乳糖(美國Sigma公司)；Sepharose 4B(美國Pharmacia公司)；DAPI(瑞士羅氏公司)；BCA蛋白試劑盒(中國碧云天公司)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。DAPI班氏試劑(無水硫酸銅1.47g，溶于100 ml熱水中，冷卻后稀釋到150 ml，取檸檬酸鈉173 g，無水碳酸鈉100 g和600 ml水共熱，溶后冷卻定容850 ml，再與150 ml硫酸銅混勻即可)；PBS(pH7.2)緩沖液(自配)。激光共聚焦顯微鏡尼康NIKONA1。

1.2 方法

1.2.1 透析法制備FITC-ALL

1.2.1.1 交聯(lián)

將5 mg紅桂木凝集素凍干粉溶于5 ml的0.15 mol·L-1磷酸二氫鈉，pH9.0溶液，稱取100 μgFITC，在4℃條件下緩慢加入上述溶液中，混合均勻，置于搖床上避光4℃反應20 h。

1.2.1.2 純化偶聯(lián)物

將偶聯(lián)物FITC-ALL在PBS緩沖液中充分透析，至透析液由黃綠色變透明清亮為止，透析過程4℃避光。偶聯(lián)物置于4℃避光保存。

1.2.1.3 偶聯(lián)物F/P值測定

測定偶聯(lián)物FITC-ALL的A495查FITC標準曲線得其FITC的濃度，用BCA蛋白試劑盒做標準曲線測定ALL的濃度，代入以下公式：

1.2.2 固化法制備FITC-ALL

1.2.2.1 ALL固相化-親和吸附

稱取紅桂木凝集素30 mg溶于5 mlPBS中，BCA蛋白試劑盒做標準曲線，計算出該溶液中蛋白質(zhì)濃度及蛋白質(zhì)總量，加30 mlSepharose4B(預先經(jīng)PBS浸泡)混勻，置于4℃冰箱過夜。次日，吸取上清液，用少量PBS洗Sepharose4B 3次；合并各次上清液，BCA蛋白試劑盒做標準曲線，計算上清液中蛋白質(zhì)含量，代入下列公式，得到紅桂木凝集素吸附率為82%。

1.2.2.2 ALL與FITC結(jié)合

稱取FITC 500 μg，溶于PBS 1 ml，逐滴加入ALL-Sepharose4B中，混勻，輕搖20 min避光4℃放置6 h。然后裝入層析柱，避光。柱用PBS洗，直至洗出液無明顯熒光為止。再改用0.2 mol·L-1Gal 0.01 mol·L-1PBS(pH7.2)緩沖液(含0.1 mol·L-1NaCl)溶液洗脫結(jié)合于Sepharose4B上的ALL-FITC，分試管收集，合并有熒光部分的洗脫液。

1.2.2.3 純化偶聯(lián)物

將偶聯(lián)物FITC-ALL在PBS緩沖液中充分透析，去除半乳糖后(用班氏試劑檢測)，避光4℃保存。

1.2.2.4 ALL-FITC質(zhì)量鑒定

1.2.3 染色

胃癌石蠟切片置于60℃烘箱烤片1 h，二甲苯脫蠟兩次各10 min，梯度酒精水化各5 min，PBS(pH7.2)緩沖液搖床震洗3次各3 min，加入FITC-ALL適量(完全覆蓋組織)，4℃避光靜置4 h，后用PBS(pH7.2)緩沖液洗3次，每次3 min，加入0.1 ug·ml-1DAPI適量(完全覆蓋組織)，4℃避光靜置30 min，在激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察。

2 結(jié)果

透析法測得F/P值為0.758，固相化法測得F/P值為1.02。在熒光標記紅桂木凝集素的方法中，固相化法較第一種方法偶聯(lián)效果好。但用兩種方法制備的FITC-ALL染胃癌切片均得到較好的效果，見圖1。

(a)固化法制備的FITC-ALL

(b)透析法制備的FITC-ALL

3 討論

凝集素是一類不同于免疫球蛋白的蛋白質(zhì)或糖蛋白，在生物界中分布廣泛，幾乎存在于各種有機體，它們的存在調(diào)節(jié)著許多生物學過程。凝集素能與糖專一地、非共價地可逆結(jié)合，這種結(jié)合的能力與配體和受體的結(jié)合特性一致，因而就把這種能與之相應的凝集素特異性親和的糖類稱之為凝集素結(jié)合受體[6]。這類結(jié)合受體多存在于細胞膜表面和胞質(zhì)，利用凝集素可與其受體特異性結(jié)合的這一特性，能夠分離純化這些細胞膜和胞漿上的糖蛋白或糖脂，并對這些糖蛋白或糖脂進行研究。由于凝集素這一特異性的識別功能，國內(nèi)外的學者都非常重視利用凝集素作為探針，以區(qū)別正常組織細胞和腫瘤細胞。用標記凝集素作為探針成為了研究腫瘤細胞上能和凝集素特異性結(jié)合的蛋白或糖脂的重要手段。凝集素由于具有多價結(jié)合能力，能與酶、熒光素、生物素、膠體金、鐵蛋白等結(jié)合而不影響其生物學活性，因此，凝集素可用于免疫細胞化學的研究，以及腫瘤的診斷評價等；目前最常用的方法之一就是用熒光標記，標記凝集素為研究體內(nèi)各種糖基化機制和信號轉(zhuǎn)導途徑提供強有力的技術(shù)支持，同時了增強了研究結(jié)果的動態(tài)性[7]。

根據(jù)文獻[5]本實驗所用ALL提取純化時采用的是0.01 mol·L-1PBS(pH7.2)緩沖液透析，所以透析法采用同樣的PBS透析，以達到去除未結(jié)合的FITC純化偶聯(lián)物的目的，但透析法在去除未結(jié)合的FITC時并不能同時去除未反應的ALL，所以實驗所需FITC的量需要絕對大于將與ALL結(jié)合的量，造成試劑的浪費。固化法的優(yōu)點是使ALL親和吸附于Sepharose4B使之固化，保護了ALL與糖反應的基團，使ALL在反應過程中保持性質(zhì)穩(wěn)定，不易失去活性，且ALL活性受FITC量、反應溫度及時間影響小。Sepharose4B吸附ALL是有活性的分子，原料中無活性或活性低的分子及反應中失去活性的分子，均隨溶液流出，達到分離的目的。固化法所制備出的偶聯(lián)物F/P值達1.02，重復性好；透析法方法簡便但制備的偶聯(lián)物F/P值較低，且透析時不能同時去除未反應的ALL，若有ALL殘留則可能使F/P值偏小，這也可能是透析法制備的偶聯(lián)物F/P值較低的原因之一，所造成的實驗誤差較大。

凝集素由于其特異性的糖結(jié)合活性等特點，在許多生物學過程中均發(fā)揮著重要的作用[7]。傳統(tǒng)的研究重點是對其的分離純化以及一般性質(zhì)的研究上，隨著分子生物學、生物技術(shù)等方面的實驗手段的發(fā)展，對凝集素的研究將著重于對其結(jié)構(gòu)和功能以及如何應用于生物、醫(yī)學方面。標記凝集素為這一研究方向提供了可行性，本實驗作為初步的開始，還需更多的優(yōu)化使熒光標記凝集素成為研究糖復合物在生理及病理條件下是如何發(fā)揮其作用的有力工具。

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4 黃忠發(fā),張淑真,藍正文,等. 利用凝集素修飾的二氧化硅玻璃球去除膠原蛋白中的內(nèi)毒素[J]. 分析化學, 2013, 41(10):1482-1486.

5 張惟杰. 糖復合物生化研究技術(shù)[M]. 杭州:浙江大學出版社, 1999.

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15 崔博,曾麒燕. 紅桂木凝集素對Jurkat T淋巴細胞生長的影響[J]. 廣西醫(yī)學, 2011, 33(04):410-413.

Comparison study of two methods labeling ALL with FITC*

Liao Lie-Jun,Yin Li-Jun,Zeng Qi-Yan△

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Guangxi Medical University, Guangxi Nanning 530021)

Objective：To investigate the method of labeling artocarpus lingnanensis lectin(ALL) with FITC. Methods: It was calculated separately the ratio of FITC to artocarpus lingnanensis lectin(ALL) of the FITC-labeled ALL made by dialysis method and solidification method. Results: The F/P ration of FITC-labeled ALL made by solidification method was 1.02, the F/P ration of FITC-labeled ALL made by dialysis was 0.758. Conclusions: Both of the two methods of labeling ALL with FITC were successful, the solidification method is better than dialysis method.

FITC; Lectin; Dialysis; Solidification

國家自然科學基金(編號：81160366)，廣西自然科學基金(桂科攻10124001A-23)

廖烈君，女，在讀碩士研究生，主要從事生物化學與分子生物學方面的研究，Email：83424777@qq.com。

△通訊作者：曾麒燕，女，教授，主要從事腫瘤免疫方面的研究，Email：zqy2002422@qq.com。

2014-12-19)