劉超等

摘 要 應(yīng)用ISSR標(biāo)記對山西省7個(gè)野生居群和1個(gè)人工栽培居群共60份西伯利亞遠(yuǎn)志種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：從100對ISSR引物中共篩選出20條多態(tài)性好、條帶穩(wěn)定的引物，60份材料DNA共獲得338個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)334個(gè)，多態(tài)性比率為98.82%；有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei's基因多樣性指數(shù)（H）及Shannon多樣性信息指數(shù)（I）分別為1.433 7、0.265 6和0.414 2，居群的遺傳相似度在0.655 2～0.977 9，表明8個(gè)居群具有豐富的遺傳多樣性，這與其自身繁殖特點(diǎn)有關(guān)；遺傳分化系數(shù)（Gst）和基因流（Nm）分別為0.526 0和0.450 5，表明居群內(nèi)和居群間均有一定程度的分化，基因流水平較低；利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，將8個(gè)居群劃分為3類。研究結(jié)果為合理引種、馴化、保護(hù)和利用西伯利亞遠(yuǎn)志野生資源提供了重要的參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞 西伯利亞遠(yuǎn)志 ；ISSR ；種質(zhì)資源 ；遺傳多樣性 ；聚類分析

分類號 Q949.753.3

西伯利亞遠(yuǎn)志（Polygala sibirica L.）為遠(yuǎn)志科（Polygalaceae）遠(yuǎn)志屬（Polygala L.）植物，是多年生草本，高10～30 cm，葉片下部小的為卵形，上部大的為披針形或橢圓狀披針形；總狀花序假頂生或腋外生；花為藍(lán)紫色，龍骨瓣較長，具流蘇狀雞冠狀附屬物；蒴果呈倒心形。全國各地均有該物種的分布。

中藥遠(yuǎn)志為中國大宗常用藥材，中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會于1977年首次將西伯利亞遠(yuǎn)志P. sibirica L.列入《中國藥典》[1]，規(guī)定其和遠(yuǎn)志P. tenuifolia Willd.同為藥用遠(yuǎn)志的2種基源植物，主治心腎不交所引起的失眠多夢、健忘驚悸、神志恍惚、咳痰不爽、瘡瘍腫毒及乳房腫痛等。關(guān)于藥用遠(yuǎn)志來源的爭議較多，王光志等[2]于2008年對藥物遠(yuǎn)志進(jìn)行了比較全面的本草考證，通過用藥歷史與名稱、品種的考證，發(fā)現(xiàn)雖然藥材品種較多，但遠(yuǎn)志古今用藥品種基本一致，均為遠(yuǎn)志P. tenuifolia Willd.與西伯利亞遠(yuǎn)志P. sibirica L.。遠(yuǎn)志最初來源于山東半島一帶，古代本草以山西、河南為道地，今以山西、陜西的質(zhì)量最好，產(chǎn)量最大，為道地產(chǎn)地。由于市場近年來對遠(yuǎn)志藥材的需求量劇增，導(dǎo)致野生資源遭到了極大破壞，遠(yuǎn)志現(xiàn)已被列入國家重點(diǎn)保護(hù)的三級野生品種中[3]。中藥遠(yuǎn)志研究主要集中在化學(xué)成分的分離鑒定和藥理作用方面，而關(guān)于遺傳多樣性的研究報(bào)道較少。

李佳等[4]曾對主產(chǎn)區(qū)遠(yuǎn)志P. tenuifolia Willd.的種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行了ISSR分析，包括野生種和栽培種，探索野生和栽培環(huán)境對遠(yuǎn)志遺傳多樣性的影響。ISSR分子標(biāo)記為第二代分子標(biāo)記技術(shù)，克服了RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性和重復(fù)性差等缺點(diǎn)[5]，且ISSR標(biāo)記多態(tài)性豐富，已被廣泛應(yīng)用于品種鑒定、多樣性分析、指紋圖譜的構(gòu)建等研究中[6]。

目前對藥用遠(yuǎn)志的研究主要集中在遠(yuǎn)志P.tenuifolia Willd.這個(gè)種，而對西伯利亞遠(yuǎn)志的研究較少。本研究利用ISSR技術(shù)對西伯利亞遠(yuǎn)志道地產(chǎn)地之一的山西省居群進(jìn)行分析，從分子水平上探討其種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，旨在為其種質(zhì)資源的開發(fā)利用及遺傳育種研究提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)材料分別采自山西省不同地區(qū)的8個(gè)居群，包括7個(gè)野生居群和1個(gè)人工栽培居群，居群代號見表1。經(jīng)過云南大學(xué)馬海英副教授鑒定可知這8個(gè)居群均為西伯利亞遠(yuǎn)志P. sibirica L.。其中太原市TZ居群10份種質(zhì)；長治市CZT 和CZY居群各5份種質(zhì)；寧武縣NWI和NWII居群各10份種質(zhì)；太原古交市TG居群5份種質(zhì)；運(yùn)城市YC居群5份種質(zhì)；呂梁市關(guān)帝山GDS居群10份種質(zhì)等。共計(jì)60份種質(zhì)，其地理信息見圖1。

1.1.2 儀器設(shè)備

紫外分光光度計(jì)；Biometra高性能PCR儀（德國Analytik Jena公司生產(chǎn)）；紫外凝膠成像儀等。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測

參照Doyle等[7]的 CTAB法，稍作改良（加入CTAB前先加入去多糖Buffer去除多糖）。稱取0.03 g干燥的植物葉片進(jìn)行DNA提取，用50 μL的0.1×TE溶液進(jìn)行溶解，在1%的瓊脂糖凝膠電泳下檢測其完整性，用紫外分光光度計(jì)測定DNA的濃度和純度，用0.1×TE溶液稀釋至20 ng/μL后于-20℃冰箱中保存。

1.2.2 引物篩選及PCR擴(kuò)增檢測

根據(jù)加拿大大不列顛哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100對ISSR引物序列進(jìn)行引物合成，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。從8個(gè)居群中各選取2個(gè)樣品的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增篩選，其中有33條引物能擴(kuò)增出條帶，對每條引物進(jìn)行退火溫度篩選，其中條帶清晰、條數(shù)較多且重復(fù)性較好的引物共計(jì)20條（表1）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在德國Analytik Jena公司生產(chǎn)的Biometra 高性能PCR儀中進(jìn)行。最終確定的反應(yīng)體系為25 μL，包括20 ng/μL的DNA、10×buffer（含MgCl2）、2.5 mmol/L 的dNTPs、5 U/μL的Easy Taq DNA聚合酶，最后以去離子水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?0個(gè)循環(huán)：95℃變性30 s；最適溫度（根據(jù)每條引物的理論退火溫度再進(jìn)行梯度PCR確定，部分種質(zhì)退火溫度見圖2和圖3）退火30 s；72℃延伸90 s；循環(huán)結(jié)束后以72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)由0.5×TBE溶液配置的2.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，在90 V電壓下于冰面上電泳1.5 h，用EB（溴化乙錠）染色后將其置于紫外凝膠成像儀中觀察并保存圖像。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

ISSR標(biāo)記為一種顯性標(biāo)記，圖譜中的每一條帶都視為1個(gè)分子標(biāo)記，有清晰條帶者記為1，同一位置無帶者記為0，采用人工計(jì)數(shù)方法根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)建立（0，1）矩陣。利用POPGENE 1.32軟件分析計(jì)算多種群遺傳多樣性和遺傳分化等指數(shù)，包括Nei's基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon信息指數(shù)（I）、多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPL）、有效等位基因數(shù)（Ne）、居群內(nèi)基因多樣性（Hs）、居群間遺傳分化系數(shù)（Gst）、基因流（Nm）、Nei's基因遺傳距離等。應(yīng)用GenAlEx6.41軟件對種群內(nèi)和種群間進(jìn)行AMOVA分析和主成分分析。利用NTSYS2.1聚類分析軟件進(jìn)行UPGMA法聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西伯利亞遠(yuǎn)志的遺傳多樣性分析

實(shí)驗(yàn)中共篩選出20條引物，擴(kuò)增出338個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)達(dá)到334個(gè)。從表2可以看出，多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPL）為98.82%。絕大多數(shù)擴(kuò)增片段大小在250～2 000 bp，部分電泳片段見圖4。8個(gè)居群中CZY居群多態(tài)性最高，其多態(tài)位點(diǎn)為243個(gè)，多態(tài)率為71.89%；多態(tài)性最低的為TG居群，其多態(tài)位點(diǎn)為38個(gè)，多態(tài)率為11.24%；栽培居群TZ的多態(tài)位點(diǎn)為163個(gè)，多態(tài)率為48.22%。用POPGENE1.32軟件分析得到的西伯利亞遠(yuǎn)志的多樣性指數(shù)見表2，Shanoon's指數(shù)（I）為0.4142；Nei's遺傳多樣性（H）為0.265 6。通過多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPL）、遺傳多樣性（H）和Shanoon's指數(shù)（I）分析可知，8個(gè)居群中多態(tài)性高低依次為CZY>CZT>TZ>NWI>NWII>GDS>YC>TG。

2.2 西伯利亞遠(yuǎn)志的遺傳結(jié)構(gòu)分析

通過POPGENE 1.32軟件分析可知，西伯利亞遠(yuǎn)志居群內(nèi)基因多樣度（Ht）為0.275 9，基因多樣性（Hs）為0.1307，遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.526 0，Nm為0.450 5。另外，通過利用GenAlex6.41軟件進(jìn)行AMOVA分析（P=0.010）可知，居群間遺傳變異占45%，居群內(nèi)遺傳變異占55%（表3）。

利用POPGENE 1.32軟件運(yùn)算8個(gè)居群中NWI和NWII居群的遺傳距離最近為0.022 4，CZT和TG居群的遺傳距離最遠(yuǎn)為0.422 8（表4）。不同居群的遺傳相似度（即遺傳一致度）在0.655 2～0.977 9，平均值為0.806 2。

2.3 西伯利亞遠(yuǎn)志的聚類分析

用GenAlex6.41軟件構(gòu)建歐式平方距離，在此基礎(chǔ)上對8個(gè)居群進(jìn)行主成分分析，以此檢測居群的遺傳相似性（圖5）。主成分分析可排除重疊和分類意義不大的條帶，使重要因素突顯出來。主成分分析結(jié)果表明，長治的2個(gè)野生居群CZY和CZT聚為一類；寧武的2個(gè)野生居群NWI和 NWII以及太原的栽培居群TZ聚為一類；太原古交的居群TG、運(yùn)城YC居群和呂梁GDS居群聚為一類。

再利用 NTSYS2.1聚類分析軟件進(jìn)行UPGMA法聚類分析，建立聚類分支樹狀圖（圖6）。 8個(gè)居群種質(zhì)在0.823和0.876處共分為3類，CZY和CZT居群為一類；NWI、 NWII和TZ居群為一類； GDS、TG和YC居群為一類。其中CZY和CZT居群與其他居群距離最遠(yuǎn)，聚類分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果基本相同。

3 討論與結(jié)論

3.1 西伯利亞遠(yuǎn)志的遺傳多樣性

本研究結(jié)果顯示，山西省西伯利亞遠(yuǎn)志居群具有豐富的遺傳多樣性（H=0.265 6，I=0.414 2，PPL=98.82%）。遺傳多樣性是生物在長期進(jìn)化和生長過程中所形成的自然屬性，受多方面因素的影響，如生殖方式、生活型、分布范圍、花粉、種子傳播方式以及演化歷史等[8]。一個(gè)物種的遺傳多樣性與其生活史特征和生態(tài)特征密切相關(guān)，分布范圍廣泛是物種遺傳多樣性高的主要因素；其次物種繁殖方式對其影響也較大[9-10]，相關(guān)學(xué)者普遍認(rèn)為多年生廣布種、異交和以種子為傳播方式等均會使植物具有較高的遺傳多樣性。

西伯利亞遠(yuǎn)志在中國均有分布，此外還分布于歐洲、俄羅斯西伯利亞、尼泊爾、印度、蒙古和朝鮮等地[11]，分布范圍廣泛。西伯利亞遠(yuǎn)志為多年生草本，花粉形態(tài)和雌雄蕊位置都表現(xiàn)出明顯的蟲煤傳粉特征，且自交不育[12]，這些特征都導(dǎo)致其具有較高的遺傳多樣性。本研究發(fā)現(xiàn)，栽培種居群TZ遺傳多樣性亦較高（H=0.151 4，I=0.230 9，PPL=48.22%），是因?yàn)榇嗽耘喾N是由直接采自野生居群的種子繁育而成的，人工露地種植環(huán)境相當(dāng)于半野生狀態(tài)。

3.2 西伯利亞遠(yuǎn)志的遺傳分化

西伯利亞遠(yuǎn)志居群的Gst為0.526 0，表明居群間遺傳變異為52.60%；AMOVA分析結(jié)果表明，居群間的遺傳變異為45%。2種方法分析結(jié)果雖然有所差異，但都表明西伯利亞遠(yuǎn)志種質(zhì)居群間出現(xiàn)了一定程度的遺傳分化。分析認(rèn)為主要是由于基因流降低而造成的，基因流是影響群體間遺傳分化的主要因素[13]。本研究中西伯利亞遠(yuǎn)志的基因流（Nm）為0.450 5，當(dāng)居群的基因流小于1時(shí)，表示遺傳漂變導(dǎo)致了居群間的遺傳分化[14]。分析認(rèn)為，西伯利亞遠(yuǎn)志基因流較低的原因是野生居群生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞導(dǎo)致的。西伯利亞遠(yuǎn)志本身生長周期長、產(chǎn)量低、生長分散，近年來的過度采挖造成其生長環(huán)境的嚴(yán)重破壞，其密度和再生能力明顯減弱，進(jìn)而使生境片段化，導(dǎo)致野生居群整體基因流降低，造成了居群間遺傳分化的加劇。

根據(jù)聚類分析和主成分分析結(jié)果將西伯利亞遠(yuǎn)志居群分為3類，這與各居群間的地理距離有一定關(guān)系。其中太原市的栽培居群TZ和寧武縣的2個(gè)野生居群NWI和NWII聚為一類，表現(xiàn)出較大的地域分布差異性，TZ居群是由野生居群引種栽培而來的，這可能是其聚類結(jié)果與其地理原產(chǎn)地之間沒有相關(guān)性的主要原因。國外學(xué)者Thimmappaiah等[15]對栽培植物腰果（Anacardium occidentale）的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生這一結(jié)果的主要原因是來自不同地方的種質(zhì)已經(jīng)進(jìn)行了基因的自由交流。

3.3 西伯利亞遠(yuǎn)志的保育策略

山西省為西伯利亞遠(yuǎn)志的道地產(chǎn)地之一，其與陜西的總產(chǎn)量占全國70%以上[16]。但如今野生西伯利亞遠(yuǎn)志資源已經(jīng)難以滿足市場需求，資源逐年銳減，有些地方甚至已經(jīng)瀕臨滅絕。而人工栽培種子來源復(fù)雜，加上其生長周期較長，對栽培技術(shù)要求高，難以形成規(guī)?；耘啵荒軡M足市場需求[17]。

野生西伯利亞遠(yuǎn)志資源具有豐富的遺傳變異，是培育優(yōu)良品種的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。可對野生資源進(jìn)行就地保護(hù)和采集種源，用以建立種質(zhì)資源圃，通過育種方式形成栽培品種，篩選出適應(yīng)不同生態(tài)環(huán)境的優(yōu)良品種，以此逐步替代野生資源，當(dāng)條件成熟時(shí)也可對野生資源進(jìn)行恢復(fù)和重建。同時(shí)提高人工栽培技術(shù)水平，建立一套完善優(yōu)質(zhì)的遠(yuǎn)志栽培技術(shù)體系，實(shí)現(xiàn)西伯利亞遠(yuǎn)志資源的可持續(xù)利用。

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