李廣興，郭德啟，王雪，葛旭影，任玉東，任曉峰，黃小丹，張瑞莉（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱50030；.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)電氣與信息學(xué)院，哈爾濱50030）

穩(wěn)定表達(dá)雞氨肽酶N的MDCK細(xì)胞系構(gòu)建及其對傳染性支氣管炎病毒感染的影響

李廣興1，郭德啟1，王雪1，葛旭影1，任玉東2，任曉峰1，黃小丹1，張瑞莉1
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)電氣與信息學(xué)院，哈爾濱150030）

為研究雞氨肽酶N（Chicken aminopeptidase N，cAPN）在雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）感染細(xì)胞過程中作用，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)cAPN的MDCK細(xì)胞系。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-cAPN通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到MDCK細(xì)胞中并利用G418篩選，克隆純化獲得穩(wěn)定表達(dá)cAPN的MDCK細(xì)胞系。通過RT-PCR和間接免疫熒光檢測表明cAPN在MDCK細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。IBV可以感染穩(wěn)定表達(dá)cAPN的MDCK細(xì)胞并連續(xù)傳代，該細(xì)胞系接種IBV陽性樣品24 h即可產(chǎn)生典型細(xì)胞融合病變，而對照MDCK細(xì)胞接種后沒有細(xì)胞病變出現(xiàn)。結(jié)果表明cAPN在介導(dǎo)IBV感染宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。

雞傳染性支氣管炎病毒；雞氨肽酶N；穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系；病毒感染

雞傳染性支氣管炎（Avian infectious bronchitis, IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus，IBV）引起的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病。臨床表現(xiàn)呼吸道癥狀和腎臟不同程度損傷，是目前危害我國養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一[1-2]。

IBV是冠狀病毒科Gamma冠狀病毒屬病毒[3]，關(guān)于IBV侵入宿主細(xì)胞的機(jī)制及雞氨肽酶N（Chicken aminopeptidase N，cAPN）在其中發(fā)揮的生物學(xué)功能均有待進(jìn)一步研究。豬APN是豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的細(xì)胞受體[4-5]，在病毒侵入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。此外，人類冠狀病毒229E（HCoV-229E）和貓腸道冠狀病毒（FeCoV）也以APN為受體[6-8]。雖然禽類組織中可分離出多種氨肽酶成分，禽類APN成分至今仍未得到確定。目前日本學(xué)者從雞卵黃中分離到的一種氨肽酶成分為APN可能性最大，這種氨肽酶具有高度糖基化，相對分子質(zhì)量約為150 000[9]。其物理性質(zhì)與人氨肽酶具有明顯相似性，Tomoaki等認(rèn)為氨肽酶Ey就是禽類APN[10]。為闡明cAPN在IBV感染宿主細(xì)胞過程中的作用，本試驗(yàn)利用IBV非易感MDCK細(xì)胞系，通過G418藥物篩選和克隆獲得cAPN穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)IBV可以感染穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系并連續(xù)傳代，表明cAPN可能作為IBV的功能受體介導(dǎo)病毒侵入細(xì)胞，cAPN穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立為臨床IBV的分離鑒定提供重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒

真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-cAPN；BHK21、MDCK和VERO細(xì)胞由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院動(dòng)物病理學(xué)教研室構(gòu)建和保存。

1.1.2 病毒與抗體

IBV Beaudette毒株、cAPN兔源抗體由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院動(dòng)物病理學(xué)教研室保存。

1.1.3 主要試劑和酶

Ex-Taq DNA聚合酶等工具酶購自TaKaRa生物試劑公司；RNA提取試劑盒購自南京凱基公司；DMEM營養(yǎng)液、G418、LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；THRIC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體；DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Trans Plus II購自北京全氏金公司。

1.2 方法

1.2.1 IBV非易感細(xì)胞系的鑒定

分別在BHK21、MDCK和IBV Beaudette毒株易感的VERO細(xì)胞上連續(xù)傳代IBV，48 h后反復(fù)凍融3次收取病毒液，將此病毒培養(yǎng)至第五代，提取第一代、第三代和第五代病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，使用IBV S1的特異性引物進(jìn)行鑒定，引物序列如下S1:GGGGAATTCATGCCCAACG AGACAAAT；S2:CCCCTCG AGTTATGTGTAAAG ACTACT。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖電泳鑒定。

1.2.2 MDCK細(xì)胞G418最低致死濃度測定

將MDCK細(xì)胞傳于24孔板，細(xì)胞長滿單層后加入G418，濃度分別為1 000、800、600、400、200、100和0μg·mL-1。每3 d換液1次，選擇10～14 d內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度進(jìn)行下一步篩選試驗(yàn)。

1.2.3 體外質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000使用說明書，將pcDNA3.1-cAPN重組質(zhì)粒用無血DMEM稀釋后，待6孔板中長滿MDCK細(xì)胞后體外傳染，同時(shí)設(shè)立pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染對照和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照。37℃5%的CO2培養(yǎng)4 h后更換無血清生長培養(yǎng)基為含有10%血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 表達(dá)cAPN的MDCK細(xì)胞篩選

轉(zhuǎn)染24 h后去掉MDCK細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗后加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每3～5 d更換1次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時(shí)，把G418濃度減半維持篩選。篩選10～14 d后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，繼續(xù)培養(yǎng)，待其逐漸增大，并將篩選出的細(xì)胞做免疫熒光染色檢測，確定有陽性細(xì)胞的細(xì)胞孔繼續(xù)下一步單克隆。

1.2.5 表達(dá)cAPN的MDCK細(xì)胞的單克隆

將擬單克隆的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到10個(gè)·mL-1。在96孔板中加入細(xì)胞懸液100μL·孔-1。培養(yǎng)9～12 d待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到24孔中擴(kuò)大培養(yǎng)。將穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系命名為MDCK-cAPN。

1.2.6 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系鑒定

1.2.6.1 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的免疫熒光鑒定

將穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系傳于24孔板培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液。4%多聚甲醛固定30 min，加入0.1 mol·L-1甘氨酸，室溫作用5 min，PBS洗3次。加入1∶200稀釋的抗cAPN抗血清，放入濕盒37℃作用1 h后用PBS洗滌3次，再加1:200稀釋的紅熒光標(biāo)記二抗，放入濕盒37℃作用1 h后用PBS沖洗3次，封片，熒光顯微鏡下觀察各種細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.2.6.2 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的RT-PCR鑒定

將穩(wěn)定表達(dá)cAPN的MDCK細(xì)胞傳于6孔板，待細(xì)胞長滿單層后提取細(xì)胞總RNA，使用OligodT-18隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用cAPN特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列為C1：GGGGGGAATTCTGAT GGCAGCCGGCTTCTTC C2：TTTTTGTCGACCTGGA GGCGGTC。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察結(jié)果。

1.2.7 病毒感染試驗(yàn)

1.2.7.1 穩(wěn)定表達(dá)系感染IBV后細(xì)胞病變觀察

將穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系傳于24孔板，24 h后細(xì)胞長滿單層，PBS沖洗1次，接種IBV并使其終濃度為1個(gè)病毒感染復(fù)數(shù)（MOI），1 h后去掉病毒接種液，PBS洗1次，換無血DMEM培養(yǎng)液，同時(shí)用易感VERO和MDCK細(xì)胞作對照，37℃培養(yǎng)觀察病變。

1.2.7.2 穩(wěn)定表達(dá)系感染IBV后病毒含量檢測

待細(xì)胞產(chǎn)生病變后仔細(xì)觀察并收獲病毒即為第一代病毒，之后繼續(xù)傳代細(xì)胞，每次用前一次收獲的病毒繼續(xù)繁殖病毒，如此連續(xù)傳代5次。將第一代、第三代和第五代病毒分別提取病毒RNA，經(jīng)OligodT-18隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄cDNA，再使用IBV S1的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 IBV非易感細(xì)胞系確定

在BHK21、MDCK和易感的VERO上繁殖IBV，鑒定結(jié)果顯示在第一代毒中，易感細(xì)胞VERO、BHK21和MDCK中均可以檢測到一定量的IBV；相互比較而言MDCK細(xì)胞僅檢測到極其微弱IBV。在第三代和第五代病毒培養(yǎng)物中，易感細(xì)胞VERO中檢測到IBV，且隨代次增加病毒含量呈遞增趨勢；但在BHK21和MDCK中均未檢測到IBV（見圖1）。所以MDCK細(xì)胞和BHK21細(xì)胞均可作為IBV的非易感細(xì)胞系，本試驗(yàn)選取MDCK作為下一步試驗(yàn)用細(xì)胞系。

2.2 G418最佳篩選濃度的確定

細(xì)胞每3 d更換1次添加不同濃度G418培養(yǎng)液，結(jié)果在第14天G418終濃度為1 000、800、600和400μg·mL-1的細(xì)胞孔中MDCK細(xì)胞已經(jīng)全部死亡，而添加濃度為200μg·mL-1的細(xì)胞孔和未添加G418的細(xì)胞孔均有大量細(xì)胞存活，所以最終確定以細(xì)胞全部死亡的400μg·mL-1為G418最佳篩選濃度。

2.3 免疫熒光染色檢測篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞

將穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系傳于24孔板，間接免疫熒光法檢測，如圖2所示與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的MDCK細(xì)胞對比，在穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中出現(xiàn)大量帶有紅色熒光信號的陽性細(xì)胞。

圖1 不同細(xì)胞系感染IBV后不同代次病毒RT-PCR鑒定Fig.1 RT-PCR identification ofdifferent passages of IBV on different celllines

圖2 免疫熒光檢測cAPN在MDCK細(xì)胞中表達(dá)情況Fig.2 Immunofluorescence analysis ofthe expression of cAPN in MDCK cellline

2.4 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的RT-PCR鑒定

將4株穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系傳于六孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)，提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后利用cAPN的特異性引物（1 906 bp）進(jìn)行RT-PCR鑒定（見圖3），待檢的4株細(xì)胞中均可檢測到cAPN目的基因，說明cAPN已成功添加到MDCK細(xì)胞基因組中。

2.5 病毒感染試驗(yàn)

在MDCK-cAPN細(xì)胞上，通過感染和未感染IBV的細(xì)胞之間的對比，可明顯看出感染IBV細(xì)胞（見圖4A）產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮變小，聚集成堆并脫落而未感染病毒的細(xì)胞（見圖4B）形態(tài)完整，輪廓清晰，生長情況良好。對照MDCK細(xì)胞感染（見圖4C）和未感染IBV（見圖4D）均未觀察到病理變化，說明IBV不會感染普通MDCK細(xì)胞。在IBV Beaudette毒株易感細(xì)胞系VERO細(xì)胞感染和未感染IBV的對比可知感染IBV細(xì)胞（見圖4E）和未感染IBV細(xì)胞（見圖4F）之間差別明顯，病毒組會產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變。通過三組不同細(xì)胞的病毒感染試驗(yàn)說明MDCK-cAPN細(xì)胞可感染和繁殖IBV。

圖3 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的RT-PCR鑒定Fig.3 RT-PCR detection of stable celllines

圖4 IBV感染MDCK-cAPN細(xì)胞后細(xì)胞病變Fig.4 Cytopathogenic effects of IBV infection in MDCK-cAPN cells

2.6 感染病毒后的RT-PCR檢測

MDCK-cAPN細(xì)胞感染和繁殖IBV收獲其一代、三代和五代病毒，提取RNA經(jīng)OligodT-18反轉(zhuǎn)錄，利用IBV-S1特異性引物RT-PCR鑒定結(jié)果如圖5，由條帶粗細(xì)對比可見，隨病毒代次增加，繁殖數(shù)量也隨之增多。

圖5 RT-PCR檢測IBV在MDCK-cAPN穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的繁殖Fig.5 Replication of IBV in MDCK-cAPN cells by RT-PCR

3 討論與結(jié)論

IB是一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病，主要引起雞呼吸系統(tǒng)疾病、腎炎和產(chǎn)蛋量下降。雞傳染性支氣管炎病毒變異率高，產(chǎn)生不同血清型，不同血清型之間交叉保護(hù)性低[11]，在臨床上常造成免疫失敗而發(fā)病，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

IBV感染和致病機(jī)理研究是綜合防治該病基礎(chǔ)，其中病毒侵染宿主細(xì)胞的機(jī)制急需闡明。各種動(dòng)物其種屬APN作為相關(guān)冠狀病毒受體介導(dǎo)病毒感染研究已有報(bào)道[5-8]，但cAPN在IBV感染宿主細(xì)胞過程中作用仍未闡明。本試驗(yàn)利用G418藥物篩選和克隆技術(shù)獲得表達(dá)cAPN的MDCK-cAPN穩(wěn)定表達(dá)系，IBV感染試驗(yàn)表明MDCK-cAPN細(xì)胞出現(xiàn)典型細(xì)胞病變，而對照組無細(xì)胞病變；病毒可在MDCK-cAPN細(xì)胞中連續(xù)傳代。以上結(jié)果表明cAPN表達(dá)與IBV感染和復(fù)制有密切關(guān)系，在IBV感染宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要生物學(xué)功能，推斷cAPN可能是IBV細(xì)胞受體。此外，IBV分離鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且成功率低，本試驗(yàn)獲得穩(wěn)定表達(dá)cAPN的MDCK細(xì)胞系可用于IBV分離和鑒定，省時(shí)省力，且易于觀察，可為IBV相關(guān)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Construction ofchicken aminopeptidase N stabilized expressed MDCK cell line and its effect on infectious bronchitis virus infection/

LI Guangxing1, GUO Deqi1,WANG Xue1,GE Xuying1,REN Yudong2,REN Xiaofeng1,HUANG Xiaodan1,ZHANG Ruili1
(1.School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2.SchoolofElectricaland Information,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin 150030,China)

To investigate the biologicalrole ofchicken aminopeptidase N(cAPN)in the process ofavian infectious bronchitis virus(IBV)infection of host cells,MDCK cells were transfected with cAPN plasmid of pcDNA3.1-cAPN,and the positive cells was cloned and screened under the drug selection of G418.The stabilized expression of cAPN positive cellline was confirmed by RT-PCR and indirect immunofluorescence assay.Virus infection experimentdemonstrated that IBV could infectand serialpropagated in this cellline,and typical cell pathogenic effect of cell fusion could also be observed 24 h post inoculation,while no changes appeared in the controlcells.Itimplies the criticalbiologicalrole ofcAPNduring IBV infection.

avian infectious bronchitis virus;aminopeptide N;stabilized expressed cellline;virus infection

S852.23

A

1005-9369（2015）10-0063-05

時(shí)間2015-10-29 13:40:56[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20151029.1340.010.html

李廣興,郭德啟,王雪,等.穩(wěn)定表達(dá)雞氨肽酶N的MDCK細(xì)胞系構(gòu)建及其對傳染性支氣管炎病毒感染的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,46(10):63-67.

Li Guangxing,Guo Deqi,Wang Xue,et al.Construction of chicken aminopeptidase N stabilized expressed MDCK cellline and its effect on infectious bronchitis virus infection[J].Journalof Northeast Agricultural University,2015,46(10):63-67.(in Chinese with English abstract)

2015-03-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31172295；31272569）

李廣興（1968-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物病理學(xué)。E-mail:ligx@neau.edu.cn