何 立，王 敏，蔣冠軍，汪志順，劉修恒

(武漢大學人民醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430060)

·基礎研究·

短暫性高血糖對大鼠腎細胞缺血再灌注損傷的影響

何 立，王 敏，蔣冠軍，汪志順，劉修恒

(武漢大學人民醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430060)

目的 觀察短暫性高血糖癥對大鼠腎臟缺血-再灌注損傷的影響。方法 雄性Wistar大鼠18只，隨機分為3組：假手術組(Sham)、缺血再灌注組(IR)、缺血再灌注+高糖組(IRH)。缺血再灌注：右腎切除，左腎動脈夾閉25 min后再灌注24 h。高糖：術前葡萄糖溶液2.5 g/kg腹腔注射。取術前(M1)、左腎動脈夾閉25 min后(M2)、再灌注24 h后(M3)的尾靜脈血檢測血糖、血肌酐和血尿素氮。HE染色觀察大鼠腎臟組織學改變；TUNEL法檢腎臟細胞的凋亡程度；Western印跡法檢測caspase 3蛋白的表達。 結果 在M3時間點，同Sham組相比，IR組血肌酐升高[ (151.68±44.29)mol/L]、caspase 3表達(0.71±0.02)增加、組織學評分(5.14±0.94)升高、 凋亡程度[(42.17±2.52)%]加重(P均<0.05)；與IR組相比，IRH組血肌酐[(348.67±9.90) μmol/L]升高、caspase 3表達(1.34±0.02)增加、凋亡程度(70.33±2.85)%加重(P均<0.05)。結論 短暫性高血糖癥可加重大鼠腎細胞的缺血-再灌注損傷。

高血糖癥；缺血-再灌注損傷；腎臟

現(xiàn)今腎移植的成功率主要受限于缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)，后者是導致移植腎功能延遲恢復(delayed graft function,DGF)的主要因素。DGF與更高的排斥率有關，在短期可能需要采用透析療法，并且導致移植存活率下降。加重缺血損傷的因素可以引發(fā)DGF，如腎臟的長時間冷藏、供體已死亡等等。最近發(fā)現(xiàn)糖尿病可能是另外一個導致DGF的因素。供體的高血糖與更差的移植腎功能恢復有關。動物模型顯示，高血糖癥可以加重缺血-再灌注損傷[1]。目前，國內(nèi)尚鮮見關于高血糖癥對腎臟缺血-再灌注損傷的研究，而國外對該研究很少、結論不完全一致[2-3]。本研究借助血清指標、組織學改變、免疫組織化學方法探討短暫性高血糖對腎臟缺血-再灌注損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康雄性Wistar大鼠18只，體重220～260 g，由武漢大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，按隨機原則分為3組，每組6只：假手術組(sham operation group，Sham)；缺血再灌注組(ischemia-reperfusion,IR)；缺血再灌注+高糖組(ischemia-reperfusion+hyperglycemia,IRH)。β-actin(內(nèi)參)、caspase 3抗體購自美國Santa Cruz公司，戊巴比妥、肝素鈉自美國Sigma公司購得。

1.2 模型制備 所有動物實驗前禁食12 h，自由飲水。sham組大鼠行2%戊巴比妥(45 mg/kg)腹腔注射麻醉，游離雙側腎臟并切除右腎，逐層縫合腹壁。IR組術前進行0.9%氯化鈉溶液(1.0 mL/kg)腹腔注射，并在假手術組的基礎上，采用無損傷血管鉗夾閉左側腎蒂25 min后解除血流阻斷，恢復灌流24 h，腎臟顏色由暗紅變?yōu)轷r紅表明再灌注良好。IRH組手術步驟與缺血再灌注組一致，氯化鈉溶液替換為25%葡萄糖溶液(2.5 g/kg)腹腔注射。

1.3 標本采集與檢測 取大鼠在術前(M1)、左腎動脈夾閉25 min后(M2)、再灌注24 h后(M3)的尾靜脈血，檢測血糖值(Glu)、血肌酐(SCr)值和尿素氮值(BUN)。取腎臟血流再灌注24 h后的腎組織標本進行切片，行HE染色觀察腎臟的組織學改變，根據(jù)評分標準(Paller法：400高倍視野下隨機選擇10個腎小管進行計分，正常腎小管計0分；刷狀緣損傷計1分；腎小管擴張計1分；細胞腫脹或扁平計1分；管腔可見壞死脫落但未形成管型的細胞碎片計1分；刷狀緣脫落計2分；形成管型計2分[4])，估算腎小管損傷面積比例，半定量評估腎小管間質(zhì)的缺血損傷程度。TUNEL法檢測腎臟細胞凋亡程度：將留取腎組織進行常規(guī)固定，經(jīng)包埋后切片為5 μm厚度，轉到多聚賴氨酸包被的玻片，置于200倍光學顯微鏡下，隨機選取6個互不重疊的視野計數(shù)陽性細胞。Western印跡法檢測caspase 3蛋白的表達。

2 結 果

2.1 各組大鼠在M1、M2、M3時間點的血糖值、血肌酐值和血尿素氮值 sham組的Wistar大鼠在M1、M2、M3各時期的血糖均維持在正常水平:由于手術應激，在M2時期略微升高，于M3時期回歸基線水平。與IR組相比，IRH組由于術前進行25%葡萄糖溶液(2.5 g/kg)腹腔注射而血糖更高(P<0.05，表1)。

sham組的血肌酐在各時期維持在正常水平，這也側面印證了血肌酐值相對來說敏感性較差，僅當腎小球濾過率(glomerular filtration rate,GFR)下降50%～60%才開始升高。與sham組相比，IR組在M3時期由于缺血-再灌注損傷而導致腎功能受損，肌酐和血尿素氮略高(P<0.05)；與IR組、sham組相比，IRH組在M3時期由于缺血-再灌注損傷而導致腎功能受損程度更重，肌酐和血尿素氮明顯升高(P<0.01)，表明腎臟急性缺血期的高血糖可能加重缺血-再灌注造成的腎損傷，使腎功能明顯下降。見表1。

表1 大鼠在M1、M2、M3時間點的血糖、血肌酐和血尿素氮值

*與sham組比較，P<0.05;△與其他2組比較;P<0.01。

2.2 HE染色鏡檢結果 IR組腎小管間質(zhì)損傷評分5.14±0.94，鏡下可見腎小管結構異常，有炎性細胞浸潤，可見細胞水腫及壞死、刷狀緣損傷脫落、管型形成，與Sham組0.52±0.60相比，腎小管計分增加(P<0.05)。IRH組評分6.95±0.81，在鏡下可見腎小管結構明顯異常，炎性細胞廣泛浸潤，可見大范圍細胞壞死、刷狀緣損傷脫落、管型形成，與IR組相比腎小管計分差異無統(tǒng)計學意義(P=0.18)。表明缺血-再灌注損傷可以導致腎小管上皮細胞受損壞死。見圖1。

2.3 TUNEL法檢測腎臟細胞凋亡結果 TUNEL法染色顯示Sham組僅有少量凋亡細胞表達；與Sham組相比，IR組的腎臟缺血-再灌注區(qū)域凋亡細胞數(shù)量增加(P<0.05)；與IR組、Sham相比，IRH組的缺血-再灌注區(qū)域凋亡細胞數(shù)量增加(P<0.05)。表明缺血-再灌注損傷可以導致腎細胞發(fā)生凋亡，而急性缺血期的高血糖可以促進這種損傷。見圖2。

圖1 3組大鼠腎臟組織學HE染色鏡檢結果(×400)

圖2 各組TUNEL法檢測腎臟細胞凋亡結果

2.4 Western印跡法檢測caspase 3蛋白表達結果 同Sham組相比，IR組的caspase 3蛋白表達增加(P<0.05)；與IR組、Sham組相比，IRH組的caspase 3蛋白表達增加(P<0.05，圖3)。

圖3 Western印跡法檢測caspase 3蛋白表達結果

3 討 論

本研究通過血清指標、組織學改變、免疫組織化學方法，表明急性缺血期的短暫性高血糖癥可加重大鼠腎細胞的缺血-再灌注損傷。這種效應的機制可能是，高血糖癥可以加重腎臟在缺血期間的氧化應激，可以通過活性氧分子數(shù)量增加反映。多個通路可以產(chǎn)生活性氧，這些通路包含的酶有過氧化物酶、NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶，在腎臟的內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞中，NADPH氧化酶及其亞型決定了活性氧的含量。動物實驗表明，上調(diào)腎臟中NADPH氧化酶的表達，可以促進炎性細胞因子、趨化因子、生長因子、粘附分子的產(chǎn)生，從而加重炎癥反應和纖維化[5]。此外，高血糖癥可通過氧化機制直接升高循環(huán)中的細胞因子濃度，而在糖耐量受損(impaired glucose tolerance,IGT)的患者中，這種效應更加明顯，表明在糖尿病患者，高血糖癥可能與免疫激活存在因果關系。臨床研究顯示，長期的高血糖癥對患者的預后有不良影響[6]。由于高血糖癥與活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的形成有關，導致心肌缺血、炎癥和心肌細胞死亡，其還被當作造成心臟損傷的首要因素[7]。

腹腔注射葡萄糖誘導大鼠發(fā)生短暫性高血糖癥，然后在缺血-再灌注發(fā)生之前使用促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)[8-9]，可以顯著減少腎小管細胞凋亡。這種效應的機制可能是源于其抗凋亡、抗炎、抗氧化特性，抑制炎性細胞因子IL-10和TNF-α的表達，還抑制caspase家族尤其是caspase 3，而caspase 3是高血糖下介導凋亡的主要因素。多聚ADP-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase,PARP)參與修復DNA損傷，對維護基因的完整性至關重要。在細胞凋亡啟動時，PARP被caspase 3剪切成兩個片段，使PARP與DNA結合的兩個鋅指結構與羧基端的催化區(qū)域分離，不能發(fā)揮正常功能；結果使受PARP負調(diào)控影響的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，造成細胞凋亡[10]。EPO和血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)已被證明可以調(diào)節(jié)腎臟缺血損傷，并且在缺血-再灌注損傷之后EPO和VEGF水平都會發(fā)生改變。VEGF可明顯促進血管再生，有利于恢復血供，因而是細胞抵抗低氧損傷的關鍵因素。在急性和慢性高血糖癥的動物模型，VEGF的表達都發(fā)生了降低[11]。低氧狀態(tài)可以激活EPO的表達，而在腎臟的缺血-再灌注損傷中EPO的表達有所下調(diào)。

不同于慢性的血糖水平升高，大多數(shù)研究使用的動物的胰島素水平正常，并且對胰島素的反應敏感，這些動物在再灌注24 h之后血糖都回歸到正常水平[12]。在慢性高血糖癥，機體的炎性狀態(tài)基線升高，增強氧化應激從而加重了器官損傷，在生理應激時這種損傷進一步惡化[13]。高血糖癥出現(xiàn)的時刻與缺血損傷緊密關聯(lián)，在缺血-在灌注損傷之前控制血糖，對腎功能的保護、防止出現(xiàn)菌血癥和貧血具有重要意義[14]。高血糖癥的持續(xù)時間不僅與器官的功能狀態(tài)有關，還能影響器官對缺血的耐受能力[15]。在腹腔注射葡萄糖之前血糖的輕微上升可能是應激引起的高血糖癥，表明可能存在一個血糖的臨界點，只有超過這個臨界點的血糖濃度才對缺血的腎臟有害。為了尋找這個臨界點，還需要進一步研究。

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(編輯 何宏靈)

Impact of transient hyperglycemia on renal cell ischemia-reperfusion injury in rats

HE Li, WANG Min, JIANG Guan-jun, WANG Zhi-shun, LIU Xiu-heng

(Department of Urology, People’s Hospital of Wuhan University,Wuhan University,Wuhan 430060,China)

Objective To investigate whether transient hyperglycemia exacerbates renal cell ischemia-reperfusion injury in rats. Methods A total of 18 male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: sham operation group (sham group); renal ischemia/reperfusion group (IR group), and renal ischemia/reperfusion + hyperglycemia group (IRH group). Hyperglycemia was induced by intraperitoneal injection of dextrose before operation. Serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN) and glucose levels were measured at baseline (M1), right after ischemic period (M2), and 24 hours after reperfusion (M3). Histological alterations were evaluated with HE staining. Renal cell apoptosis was estimated with TUNEL staining assay. The expression of caspase 3 was analyzed with Western blotting. Results At the point of M3，in the IR group, the levels of SCr [(151.68±44.29)μmol/L] and caspase 3 (0.71±0.02) were upregulated, Paller’s score (5.14±0.94) was higher and the number of apoptotic cells [(42.17±2.52)%] was larger, compared with the sham group (allP<0.05). In the IRH group, the levels of SCr [(348.67±9.90)μmol/L] and caspase3 (1.34±0.02) were increased, and the number of apoptotic cells [(70.33±2.85)%] was larger, compared with the IR group (allP<0.05). Conclusion Transient hyperglycemia can deteriorate renal cell ischemia-reperfusion injury in rats.

hyperglycemia; ischemia-reperfusion injury; kidney

2015-02-14

2015-04-07

劉修恒，教授，博士生導師.E-mail：champagnemw@gmail.com

何立(1988-)，在讀碩士，研究方向為泌尿系統(tǒng)腫瘤及結石的治療.E-mail: champagnemw@gmail.com.

R619.9

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.07.018