李宏旭，田 樺，程 開(kāi)，卓 越

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

HSP27及其磷酸化蛋白的表達(dá)對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎細(xì)胞骨架穩(wěn)定性的影響①

李宏旭，田 樺，程 開(kāi)，卓 越

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探討小熱休克蛋白(HSP27)及其磷酸化蛋白(p-HSP27)表達(dá)對(duì)急性胰腺炎(AP)模型大鼠細(xì)胞骨架保護(hù)性作用的研究。方法：將45只正常成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分空白對(duì)照組(A組)、急性胰腺炎組(B組)、假手術(shù)組(C組)。實(shí)驗(yàn)前12h禁食，正常飲水，確定AP動(dòng)物模型建立成功后于1h、3h、6h三個(gè)時(shí)間段處死大鼠，且隨機(jī)每個(gè)時(shí)間段每組各處死5只。確定動(dòng)物模型建立成功，Western-blotting檢測(cè)HSP27及其磷酸化蛋白含量，RT-PCR檢測(cè)HSP27mRNA表達(dá)。結(jié)果：急性胰腺炎組大鼠各時(shí)間點(diǎn)SAM值明顯高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.05)；急性胰腺炎組大鼠各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織HSP27蛋白、p-HSP27蛋白(Ser15)和HSP27mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.05)。結(jié)論：在AP早期胰腺細(xì)胞骨架穩(wěn)定性出現(xiàn)明顯變化，HSP27及其p-HSP27含量及HSP27mRNA表達(dá)明顯升高，提示HSP27在AP早期對(duì)胰腺細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性起到非常重要作用。

急性胰腺炎；細(xì)胞骨架；HSP27；p-HSP27

急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制經(jīng)研究顯示是機(jī)體通過(guò)酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生的氧自由基，直接攻擊生物膜的多不飽和脂肪酸，從而引發(fā)脂質(zhì)的過(guò)氧化形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，此氧化應(yīng)激損傷使胰腺細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性受到嚴(yán)重影響。急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展時(shí)，哺乳細(xì)胞體內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路會(huì)發(fā)生一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而對(duì)細(xì)胞骨架，包括微管(microtubule,MT)、微絲(microfilament,MF)和中間纖維(intermediate,IF)起到重要的調(diào)節(jié)作用。小熱休克蛋白27(HSP27)及其磷酸化形式通過(guò)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞調(diào)節(jié)，表達(dá)增高可以增加受到毒性刺激的細(xì)胞的生存率[1]，不利的應(yīng)激環(huán)境可使HSP27迅速合成[2]及其易發(fā)生磷酸化后在蛋白質(zhì)水平上起到防御和保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HSP27及其磷酸化蛋白表達(dá)，觀察其對(duì)急性胰腺炎大鼠模型氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法[3～5]1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性Wistar大鼠(n=45)，體重180～220g，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器

?；悄懰徕c(天津索羅門(mén)生物科技有限公司)；10%水合氯醛、0.9%氯化鈉、75%乙醇(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院)；淀粉酶檢測(cè)試劑盒(Gal-G2-CNP底物法)(日本YZB/JAP4125-2014)；兔抗HSP27(BA0475，武漢博士德公司)；HSP27磷酸化(p-HSP27)抗體(Ser15)(UpState，深圳精美公司)；二抗試劑盒(武漢博士德公司)；TGL-16M/MI臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘麗離心機(jī)有限公司)；DYCP-44P快速凝膠電泳儀(槽)，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；UV755B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海；PCR擴(kuò)增儀PCRSystem9700，美國(guó)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將正常雄性Wistar大鼠45只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(A組)、急性胰腺炎組(B組)、假手術(shù)組(C組)，每組15只，每籠喂養(yǎng)5只。三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在同等條件下給予正常飼料和高溫滅菌自來(lái)水喂養(yǎng)，4周后，體重180～220g，實(shí)驗(yàn)前12h禁食(自由飲水)，急性胰腺炎組腹腔注射10%水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉動(dòng)物后剖腹,找膽胰管行?；悄懰徕c膽胰管逆行注射(?；悄懰徕c：濃度5%，注射劑量：0.lmL/l00g，注射速度：0.lmL/min)造模；空白對(duì)照組麻醉剖腹后不予任何處理；假手術(shù)組麻醉剖腹后給予等劑量生理鹽水膽胰管逆行注射。各組動(dòng)物造模后隨機(jī)于1h、3h、6h(每時(shí)點(diǎn)n=5)取腹主動(dòng)脈血，通過(guò)采用淀粉酶檢測(cè)試劑盒(Gal-G2-CNP底物法)進(jìn)行測(cè)定血清淀粉酶(SAM)確定動(dòng)物模型成功。切取十二指腸窗內(nèi)胰腺組織(約250～300mg)，采用western-blotting方法檢測(cè)HSP27蛋白及其磷酸化蛋白含量并使用QuantityOne軟件對(duì)

圖像進(jìn)行灰度值分析、采用RT-PCR方法檢測(cè)HSP27mRNA水平的相對(duì)表達(dá)并使用LabWorks軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1Gal-G2-CNP底物法檢測(cè)各組大鼠血清淀粉酶(SAM)的檢測(cè)

結(jié)果顯示，B組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶值均明顯高于同時(shí)間點(diǎn)的A組、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組隨時(shí)間延長(zhǎng)血清淀粉酶值明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠SAM值(U/L)隨時(shí)間變化情況

注：*與A組比較P<0.05；#各時(shí)點(diǎn)與相應(yīng)1h比較P<0.05；△與B組比較P<0.05。

2.2Western-blotting檢測(cè)各組大鼠胰腺組織HSP27蛋白、p-HSP27蛋白(Ser15)相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)

結(jié)果顯示，B組大鼠胰腺組織中HSP27蛋白、p-HSP27蛋白(Ser15)的相對(duì)表達(dá)量明顯高于A、C組。如表所示，B組HSP27蛋白、p-HSP27蛋白(Ser15)均呈現(xiàn)高表達(dá)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠HSP27及p-HSP27蛋白

注：*與A組比較P<0.05；#各時(shí)點(diǎn)與相應(yīng)1h比較P<0.05；△與B組比較P<0.05。

2.3RT-PCR檢測(cè)各組大鼠胰腺組織HSP27mRNA表達(dá)水平

結(jié)果顯示，B組大鼠HSP27mRNA表達(dá)水平明顯高于A、C組，A組和C組HSP27mRNA均呈現(xiàn)低表達(dá)(P<0.05)。如圖所示，B組大鼠HSP27mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于A、C組。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織HSP27mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化情況

3 討論

?；悄懰徕c誘導(dǎo)的急性胰腺炎模型早期就可出現(xiàn)胰腺細(xì)胞的損傷，大量胰腺細(xì)胞被破壞，可表現(xiàn)為細(xì)胞極性消失、細(xì)胞間隙擴(kuò)大及纖維肌動(dòng)蛋白微絲降解等，最終導(dǎo)致細(xì)胞骨架發(fā)生劇烈的改變[6]。小熱休克蛋白27(HSP27)是肌動(dòng)蛋白actin聚合的磷酸化依賴(lài)性調(diào)控因子[7，8]，HSP27蛋白及其磷酸化蛋白的變化可調(diào)控細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，其核內(nèi)定位信號(hào)主要通過(guò)MAPK信號(hào)通路重新組裝核內(nèi)結(jié)構(gòu)并參與調(diào)節(jié)各分子生成過(guò)程。HSP27在細(xì)胞內(nèi)的過(guò)表達(dá)，可在一定程度上對(duì)某些刺激(如氧化應(yīng)激反應(yīng))有相應(yīng)的抵抗作用。研究表明，有害應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP27蛋白可抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)后續(xù)細(xì)胞損傷有一定的抵抗，特別對(duì)肌動(dòng)蛋白actin的調(diào)控有保護(hù)作用[9]。磷酸化后的HSP27可在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能使紊亂的細(xì)胞骨架更具穩(wěn)定性，即使微管蛋白結(jié)合更緊密，阻止微絲的分裂及避免中間纖維發(fā)生異常聚合。在之前的研究中,我們發(fā)現(xiàn)在?；悄懰徕c誘導(dǎo)的膽源性急性胰腺炎早期就出現(xiàn)了細(xì)胞骨架的解聚[10]。本研究通過(guò)構(gòu)建AP大鼠模型，進(jìn)一步在蛋白水平對(duì)?；悄懰徕c誘導(dǎo)的膽源性急性胰腺炎早期細(xì)胞骨架的改變進(jìn)行驗(yàn)證，并初步確定了HSP27及其磷酸化蛋白，參與細(xì)胞骨架的保護(hù)機(jī)制。

研究結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物急性胰腺炎的早期，HSP27蛋白的表達(dá)量升高，隨病程進(jìn)展HSP27表達(dá)量進(jìn)一步增高，p-HSP27蛋白及mRNA表達(dá)量均升高。出現(xiàn)這種表現(xiàn)的主要原因可能是由于在急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展中，產(chǎn)生大量的活性氧自由基，引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，并最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷。HSP27蛋白是細(xì)胞連接復(fù)合體結(jié)構(gòu)的調(diào)控因子，基于以上這種氧化應(yīng)激損傷的誘導(dǎo)， 進(jìn)而激活其自身及p-HPS27蛋白的高表達(dá)，發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞骨架的保護(hù)作用。在空白對(duì)照組中的HSP27 蛋白及其磷酸化蛋白、HSP27mRNA呈現(xiàn)低表達(dá)；在假手術(shù)組中，

細(xì)胞的結(jié)構(gòu)較完整，HSP27蛋白及其磷酸化蛋白的表達(dá)亦呈低表達(dá)，其兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見(jiàn)，HSP27蛋白及其磷酸化蛋白在對(duì)穩(wěn)定細(xì)胞骨架的調(diào)控中起到關(guān)鍵的作用；在對(duì)細(xì)胞有害的應(yīng)激環(huán)境中，HSP27蛋白也將對(duì)保護(hù)胰腺細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用。這可能與HSP27蛋白在MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中易發(fā)生磷酸化，并以磷酸化方式進(jìn)行調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)有關(guān)。

本研究揭示了在AP早期的發(fā)生發(fā)展中，氧化應(yīng)激損傷可使細(xì)胞骨架穩(wěn)定性降低，同時(shí)可導(dǎo)致HSP27蛋白及其磷酸化蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。HSP27蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)顯著升高，這說(shuō)明胰腺細(xì)胞骨架受到氧化損傷程度更劇烈，提示以磷酸化方式調(diào)節(jié)胰腺細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的HSP27蛋白對(duì)細(xì)胞骨架穩(wěn)定性具有一定的保護(hù)作用，為深入探討急性胰腺炎的損傷機(jī)制提供了理論依據(jù)。

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The effects of the expressions of HSP27 protein and its phosphorylated protein on experimental acute pancreatitis cell skeleton stability

LIHong-xu，TIANHua，CHENGKai,ZHUOYue

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003, China)

Objective: To investigate the protective effect of small heat shock protein (HSP27) and its phosphorylated protein (p-HSP27) expression on rat skeleton model of acute pancreatitis (AP). Methods: 45 normal adult male Wistar rats were randomly divided into three groups, which were the control group (A), the acute pancreatitis group (B), and the sham group (C). All the rats were fasted for 12 hours and drank water normally before the experiment. Five rats were killed in each group at 1h, 3h, and 6h after determining the animal model of AP successfully. The serum amylase (SAM) was detected by using Gal-G2-CNP to determine the success of model. The Western-blotting and RT-PCR were used to detect the content of HSP27 and its p-HSP27 and the expression of HSP27mRNA, respectively. Results: SAM values of acute pancreatitis group at each point were significantly higher than those in control group and sham group (P<0.05).TherelativeexpressionofacutepancreatitisgroupateachtimepointforHSP27protein,p-HSP27protein(Ser15)andHSP27mRNAweresignificantlyhigherthanthatincontrolgroupandshamgroup(P<0.05). Conclusion: The skeleton stability for pancreatic cells in the early AP was changed significantly. The contents of HSP27 protein and its p-HSP27 and the expression of HSP27mRNA are increased significantly. The results suggested that HSP27 expression plays an important role on the stability of cytoskeleton of in the early age of AP.

acute pancreatitis; cytoskeleton; HSP27; p-HSP27

佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新科技課題，編號(hào)：LM2014-036；佳木斯大學(xué)科技項(xiàng)目，編號(hào)：S2011-38；S2009-060。

李宏旭(1988～)女，黑龍江雞西人，在讀碩士研究生。

卓越(1964～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail: zhuoyuejmsu@126.com。

R576；Q245 文章類(lèi)別：A

1008-0104(2015)02-0072-03

2014-01-06)