徐春燕

四川廣元市精神衛(wèi)生中心神經(jīng)內(nèi)科 廣元 628000

血栓通改善腦血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的作用機(jī)制

徐春燕

四川廣元市精神衛(wèi)生中心神經(jīng)內(nèi)科 廣元 628000

目的 探討血栓通在改善腦血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的作用機(jī)制。方法 選擇在體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，分為對(duì)照組（正常內(nèi)皮細(xì)胞組）、血栓通組（血栓通＋正常內(nèi)皮細(xì)胞組）、缺氧組（模擬缺氧內(nèi)皮細(xì)胞）和缺氧血栓通組（血栓通＋模擬缺氧內(nèi)皮細(xì)胞）。采用CCK－8試劑盒觀察各組內(nèi)皮細(xì)胞的活性，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果 與對(duì)照組比較，應(yīng)用血栓通培育內(nèi)皮細(xì)胞后，隨著時(shí)間的推移，內(nèi)皮細(xì)胞活性呈明顯上升趨勢(shì)；而與血栓通組比較，缺氧組內(nèi)皮細(xì)胞活性明顯下降；在血栓通干預(yù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性逐漸增加，以24h效果最顯著。與常規(guī)缺氧對(duì)照組比較，缺氧血栓通組內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率顯著降低，而缺氧誘導(dǎo)因子抑制HIF的表達(dá)后，缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率顯著升高，最后在血栓通處理后，其內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率顯著較血栓通未處理的缺氧誘導(dǎo)因子抑制組明顯降低。結(jié)論 血栓通可以明顯提高缺氧血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞處于持續(xù)缺氧狀態(tài)時(shí)，還可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

血栓通；腦血管內(nèi)皮細(xì)胞；缺氧損傷；作用機(jī)制

缺血性腦卒中是臨床上非常常見的一類疾病，最常見的有短暫性缺血發(fā)作、急慢性腦梗死等［1］。然而，在不同程度的缺血發(fā)病機(jī)制過(guò)程中，必然存在一定的缺氧［2］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子在缺血性腦血管病變中發(fā)揮保護(hù)作用，可以促使缺氧內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一種缺氧適應(yīng)，一定程度抑制了疾病的進(jìn)展［3］。血栓通是臨床上較為常見的一種治療缺血性腦血管病的中成藥制劑，臨床療效顯著，而對(duì)其具體作用機(jī)制的研究仍較少。我院研究了血栓通在改善腦血管內(nèi)皮細(xì)胞單純?nèi)毖鯎p傷的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)于上海拜力生物科技有限公司細(xì)胞庫(kù)。（2）主要試劑：血栓通超微粉由我院研制（100701），貯存液的配制：稱取一定量血栓通超微粉溶解于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，超聲波溶解1h，3 600r／min，離心10min，取上清液，過(guò)濾除菌，將剩余沉淀物于60℃條件下加熱烘干，計(jì)算血栓通實(shí)際溶解濃度，制備成2 000mg／L血栓通超微粉備用。

1.2 方法

1.2.1 分組：①對(duì)照組（正常內(nèi)皮細(xì)胞組）：正常條件下進(jìn)行培養(yǎng)；②血栓通組（血栓通＋正常內(nèi)皮細(xì)胞組）：加入含通心絡(luò)超微粉（終濃度為100mg／L）聯(lián)合正常內(nèi)皮細(xì)胞正常條件下進(jìn)行培養(yǎng)；③缺氧組（模擬缺氧內(nèi)皮細(xì)胞）：95%N2＋4%CO2＋1%O2條件下培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞；④缺氧血栓通組（血栓通＋模擬缺氧內(nèi)皮細(xì)胞）：加入含通心絡(luò)超微粉（終濃度為100mg／L）聯(lián)合95%N2＋4%CO2＋1%O2條件下培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞活性的測(cè)定：操作嚴(yán)格CCK－8試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)試劑各組內(nèi)皮細(xì)胞分別于缺氧0h、12h、24h、48h后測(cè)定細(xì)胞活性，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組內(nèi)皮細(xì)胞活性改變比較 與對(duì)照組比較，血栓組隨著時(shí)間的推移，內(nèi)皮細(xì)胞活性呈明顯上升趨勢(shì)；與血栓通組比較，缺氧組內(nèi)皮細(xì)胞活性明顯下降；在血栓通干預(yù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性逐漸增加，以24h效果最顯著。見表1。

表1 各組內(nèi)皮細(xì)胞活性改變情況比較 （±s）

表1 各組內(nèi)皮細(xì)胞活性改變情況比較 （±s）

注：與對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與缺氧組比較，＃P＜0.05；與對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01

組別0h12h24h48h對(duì)照組1.101±0.046 8.201±0.432 8.299±0.465 8.899±0.547血栓通組1.097±0.043 8.983±0.451 10.012±0.511 12.013±0.997缺氧組1.100±0.045 6.245±0.409＊6.198±0.439＊5.224±0.325＊＊缺氧血栓通組1.098±0.047 7.778±0.460 8.301±0.558＃6.338±0.361

2.2 缺氧誘導(dǎo)因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 與常規(guī)缺氧對(duì)照組比較，缺氧血栓通組內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率顯著降低，而缺氧誘導(dǎo)因子抑制HIF的表達(dá)后，缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率顯著升高，在血栓通處理后，其內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率較血栓通未處理的缺氧誘導(dǎo)因子抑制組明顯降低。見表2。

表2 缺氧誘導(dǎo)因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 （±s）

表2 缺氧誘導(dǎo)因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 （±s）

注：與常規(guī)缺氧組比較，＊P＜0.05；與缺氧誘導(dǎo)因子抑制組比較，＃P＜0.05；與常規(guī)缺氧組比較，＊＊P＜0.01，與缺氧誘導(dǎo)因子抑制組比較，＃＃P＜0.01

組別0h12h24h48h缺氧組1.035±0.061 13.552±1.632 21.997±1.876 31.9 44.729±2.973 99±2.671缺氧血栓通組1.029±0.055 8.001±0.523＊＊8.445±0.583＊＊15.446±1.042＊＊缺氧誘導(dǎo)因子抑制組1.033±0.057 21.003±1.980＊29.225±2.345＊＊46.571±3.004＊＊缺氧血栓通誘導(dǎo)因子抑制組1.032±0.056 14.329±1.231＃＃24.374±2.003＃

3 討論

血栓通在臨床上應(yīng)用較廣泛，主要成分三七總皂苷，具有活血祛瘀、擴(kuò)張血管、改善血液循環(huán)的作用，在臨床治療腦血管缺血性疾病方面有很好的臨床療效［4］。而有關(guān)血栓通在改善腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制相對(duì)甚少［5］。而腦血管缺血性疾病的具體發(fā)病機(jī)制不明，但許多相關(guān)研究表明持續(xù)缺血造成的缺氧在介導(dǎo)疾病進(jìn)展方面發(fā)揮了重要作用。腦血管缺血缺氧性疾病患者中存在一種缺氧誘導(dǎo)因子［6－7］，其在細(xì)胞漿中穩(wěn)定表達(dá)，而HIF－1α亞基在翻譯后即被泛素－蛋白酶水解復(fù)合體降解。因此，在正常氧飽和度下的細(xì)胞中基本檢測(cè)不到亞基的表達(dá)，而在缺氧狀態(tài)下，僅亞基的降解被抑制，1α和β亞基形成有活性的HIF－1，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄。它可以編碼促紅細(xì)胞生成素基因，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因、胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ基因、內(nèi)皮素－1、血小板源性生長(zhǎng)因子、葡萄糖載體蛋白1、3和糖酵解酶，包括醛縮酶A、烯醇化酶1、乳酸脫氫酶A、磷酸果糖激酶L、磷酸甘油酸激酶1、己糖基酶，2、3－磷酸甘油醛脫氫基因等，參與調(diào)解缺氧耐受反應(yīng)［8－9］。

血栓通在治療腦血管缺血性疾病方面是否可以對(duì)缺氧機(jī)制產(chǎn)生一定的抑制作用引起了我們的重視，故我院開展了血栓通在改善腦血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的作用機(jī)制探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）與對(duì)照組比較，應(yīng)用血栓通培育內(nèi)皮細(xì)胞后，隨著時(shí)間的推移，內(nèi)皮細(xì)胞活性呈明顯上升趨勢(shì)；而與血栓通組比較，缺氧組內(nèi)皮細(xì)胞活性明顯下降；在血栓通干預(yù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性逐漸增加，以24h效果最顯著。血栓通可以明顯提高缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的活性，促進(jìn)其缺氧耐受。（2）與常規(guī)缺氧對(duì)照組比較，缺氧血栓通組內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率顯著降低，而缺氧誘導(dǎo)因子抑制HIF的表達(dá)后，缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率顯著升高，最后在血栓通處理后，其內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率顯著較血栓通未處理的缺氧誘導(dǎo)因子抑制組明顯降低。另外，血栓通可以明顯降低缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，減少細(xì)胞快速壞死。這些作用機(jī)制可能與血栓通對(duì)于缺血誘導(dǎo)因子的調(diào)節(jié)有關(guān)，一方面上調(diào)缺血誘導(dǎo)因子；另一方面可能發(fā)揮了缺血誘導(dǎo)因子抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［10］。

綜上所述，血栓通可以明顯提高缺氧血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞處于持續(xù)缺氧狀態(tài)時(shí)，還可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（收稿2014－12－18）

The mechanism exploration of how Xueshuantong improving the function of hypoxia－injured cerebral vascular endothelial cells

Xu Chunyan
Department of Neurology，the Guangyuan Psychiatric Health Center，Guangyuan62800，China

Xueshuantong；Cerebral vascular endothelial cells；Hypoxic injury；Mechanism

R743

A

1673－5110（2015）24－0014－03

【Abstract】Objective To explore the mechanism of how Xueshuantong improving the function of hypoxia－injured cerebral vascular endothelial cells.Methods The cultured human umbilical vein endothelial cells in vitro were selected as research subjects，which were divided into the control group（only including normal endothelial cells），Xueshuantong group（normal endothelial cells＋Xueshuantong），hypoxia group（simulated hypoxic endothelial cells）and hypoxia Xueshuantong group（Xueshuantong＋stimulated hypoxic endothelial cells）.The endothelial cell activity of all groups was observed using the kit uses CCK－8，and the condition of endothelial cell apoptosis was analyzed by flow cytometric method.Results Compared with the control group，as time went on，the activity of endothelial cells was gradually increased following the Xueshuantong application to the cultivation of endothelial cells.Hypoxia group decreased the activity of endothelial cells，which were advanced at each point after the Xueshuantong intervention and peaked at 24hours.Compared with hypoxia group，hypoxia Xueshuantong group had obviously lower apoptosis rate of endothelial cells，which was markedly elevated after the inhibitory expression of HIF by hypoxia－inducible factors，and was increased once again after Xueshuantong intervention finally.As noted，the apoptosis rate was significantly lower than that before Xueshuantong intervention.Conclusion Xueshuantong can significantly improve the activity of injured vascular endothelial cells induced by hypoxia，and can inhibit the cell apoptosis when under the state of continuous hypoxia.The specific molecular mechanism remains to be investigated further.