吳群英 莫小梅 黃嵐珍 王凌宇 黃 江 肖福英

（桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

白褲瑤是瑤族中民族特色保留較為完整的支系之一，自稱“努格勞”，因其男子穿及膝的白褲而得名“白褲瑤”,主要集居在廣西南丹縣和貴州荔波縣相接壤的里湖瑤族鄉(xiāng)、八圩瑤族鄉(xiāng)和瑤山瑤族鄉(xiāng)等地[1]。人類線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是一個(gè)由16569個(gè)堿基組成的閉合環(huán)狀雙鏈分子，由于母系遺傳的特性，缺乏重組、進(jìn)化速率高、群體內(nèi)變異大等特點(diǎn)，而被廣泛地應(yīng)用于人類群體的起源、演化和親緣關(guān)系以及疾病的遺傳的研究。本文采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR）技術(shù)及DNA測序法對廣西南丹白褲瑤族mtDNA D-Loop HVRⅠ區(qū)進(jìn)行了研究,為少數(shù)民族群體遺傳學(xué)研究提供新的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

31名體檢健康的白褲瑤樣本均采自廣西河池市南丹縣，彼此間無親緣關(guān)系，3代均為白褲瑤族，所有研究對象均知情同意。

1.2 mtDNA的提取

用消毒棉簽刮取口腔黏膜細(xì)胞，浸泡于生理鹽水中，將采集口腔黏膜細(xì)胞的棉簽用生理鹽水把口腔細(xì)胞清洗出來于1.5mlEP管中，進(jìn)行13000 rpm，離心15min，小心棄去上清，然后加入200ul 10%chelex100樹脂，56℃水浴30min，取出后振蕩5-10s,100℃水浴 10min，離心3min，4℃保存，上清用于PCR擴(kuò)增。

1.3 HVRⅠ區(qū)的PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)總體積為 50ul，引物各 1 umol/L,上游引物：5’-TTAACTCCACCA -TTACCACC -3’， 下 游 引 物 ：5’ -GAGGATGGTGGTCAAGGGAC-3’（由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，擴(kuò)增片段長度為 440bp），2×Taq PCR Master Mix 25ul,DNA模板5ul，去離子水補(bǔ)足50 ul。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1min，94℃變性30s，58℃退火 30s，72℃延伸 30s，30個(gè)循環(huán)后 72℃延伸 10min。

1.4 PCR產(chǎn)物的檢測及測序

每個(gè)樣品均取10μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色觀察擴(kuò)增結(jié)果；40ulPCR產(chǎn)物委托上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

測序結(jié)果與劍橋標(biāo)準(zhǔn)Anderson序列比較，統(tǒng)計(jì)變異位點(diǎn)及變異類型。按照公式P=∑x2(x為每個(gè)個(gè)體單倍型頻率)計(jì)算偶合概率,按公式h=(1-∑x2)n/(n-1)(n為樣本含量)計(jì)算基因變異度。

2 結(jié)果

2.1 HVRⅠ區(qū)的PCR擴(kuò)增

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物大小及純度，結(jié)果表明，31例白褲瑤樣本均成功擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為440bp（見圖1）。

圖1 HVR I區(qū)的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.2 HVRⅠ區(qū)的多態(tài)性

將31例白褲瑤族HVRⅠ區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，所得的核苷酸序列分別與Anderson標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較，共檢測出88個(gè)突變位點(diǎn)，其中以堿基置換為主，包括30個(gè)堿基轉(zhuǎn)換，57個(gè)堿基顛換，1個(gè)堿基缺失，1個(gè)堿基插入。堿基顛換明顯高于堿基轉(zhuǎn)換、插入及缺失，堿基顛換占總堿基變異的64.77%，其中A-C的顛換占總堿基變異的39.44%（見圖 2）。

圖2 HVRⅠ區(qū)測序的核苷酸序列與Anderson標(biāo)準(zhǔn)序列對比結(jié)果

2.3 HVRⅠⅠ區(qū)基因變異度和偶合概率結(jié)果

按照公式P=∑x2(x為每個(gè)個(gè)體單倍型頻率)計(jì)算偶合概率,公式h=(1-∑x2)n/(n-1)(n為樣本含量)計(jì)算基因變異度[2]。計(jì)算得出偶合概率為0.25，基因變異度分別為1.00。由此說明，廣西白褲瑤族線粒體DNA HVRⅠ區(qū)具有較高的序列多態(tài)性。

2.4 mtDNA HVRⅠ區(qū)14bp高變結(jié)構(gòu)域

Anderson序列在16180-16193位置有一個(gè)14bp富含C的高變結(jié)構(gòu)域,連續(xù)9個(gè)C被16189位點(diǎn)的T隔開,其長度及序列因受堿基插入、缺失、轉(zhuǎn)換、顛換等影響而出現(xiàn)個(gè)體間序列多態(tài)性,該區(qū)域也具有典型的人類學(xué)特征。本研究出現(xiàn)3種單倍型,分別為：AAAACCCCCTCCCC(2個(gè)),AAAACCCCCTCCTC（1 個(gè)),AACCCCCCCCCCCC(1 個(gè))。

3 討論

線粒體DNA D-loop環(huán)區(qū)在人類學(xué)研究上是非常有價(jià)值的DNA區(qū)段,比較研究相應(yīng)區(qū)段的序列間差異和變異速率,可以獲得豐富的進(jìn)化信息,為人類起源、進(jìn)化和人群的遷移提供可靠的遺傳信息。本研究選擇廣西白褲瑤族群體進(jìn)行線粒體HVRⅠ區(qū)序列分析,研究結(jié)果表明在線粒體DNA HVRⅠ區(qū)有多個(gè)堿基突變,這表明廣西白褲瑤線粒體DNA HVRⅠ區(qū)具有高度序列多態(tài)性,可以作為法醫(yī)學(xué)個(gè)體識別的遺傳標(biāo)記。從廣西白褲瑤族線粒體DNA HVRⅠ區(qū)堿基突變類型來看，突變以堿基顛換為主，然而HVRⅢ區(qū)堿基突變卻是以堿基轉(zhuǎn)換為主,以嘧啶(T-C)之間的轉(zhuǎn)換最多,這個(gè)結(jié)果支持mtDNA的突變是由于DNA在復(fù)制時(shí)錯(cuò)配所造成[3]。

本研究中發(fā)現(xiàn)白褲瑤族的有些位點(diǎn)與其他東亞人群間確實(shí)存在差異,白褲瑤族人在nt16093及nt16183位置分別出現(xiàn)T-C和A-C堿基替換,而中國漢族人[5]、日本人[6]、朝鮮人[7]卻未發(fā)現(xiàn)上述部位的堿基突變,表明白褲瑤族在進(jìn)化過程中保留了其獨(dú)特的遺傳特征。此外,由于nt16189位出現(xiàn)T-C堿基轉(zhuǎn)換導(dǎo)致nt16180-16193區(qū)域形成的的poly-C(C重復(fù))序列,日本人[6]、朝鮮人[7]分別有16、19種單倍型,白褲瑤族只有3種。白褲瑤族單倍型少,是否與樣本量有關(guān),還需要進(jìn)一步證實(shí)。

［1］田培燕,陳應(yīng)康,羅惠,等.白褲瑤人群12對遺傳性狀的基因頻率[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2009,36(8).

［2］Tajima F.Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism[J].Genetics,1989,123:585-595.

［3］Bendall KE,Sykes BC.Length heteroplasmy in the first hypervariable segment of the human mtDNA control region[J].Am J Hum Genet,1995,57(2):248-256.

［4］劉雅誠,嚴(yán)江偉,唐暉,等.中國5個(gè)民族 mtDNA(CA)n重復(fù)的多態(tài)性[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2003,18(1):37-38.

［5］Nishimaki Y,Sato K,Fang L,etal.Sequence polymorphism in the mtDNA HVS-I region in Japanese and Chinese[J].Legal Med,1999,1(4):238-249.

［6］Horai S,Hayasaka K.Intraspecific nucleotide sequence differences in the major noncoding region of human mitochondria DNA[J].Am J H um Gen et,1990,46(4):828-842.

［7］Lee SD,Shin CH,Kim KB,etal.Sequence variation of mitochondrial DNA control region in Korean s[J].Forensic Sci Int,1997,87(2):99-116.

［8］Poulton J,Luan J,Macaulay V,et al.Type 2 diabetes is associated with a common mitochondrial variant:evidence from a population-based case-control study[J].Hum Mol Genet,2002,Jun 15,11(13):1581-1583.