張強(qiáng)，劉友，張中海

(徐州醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室，江蘇 徐州 221004)

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原兒茶酸對(duì)帕金森模型大鼠血清TNF-α、IL-1β及氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平的影響

張強(qiáng)Δ，劉友，張中海

(徐州醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室，江蘇 徐州 221004)

目的 探討原兒茶酸對(duì)帕金森模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)及氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平的影響。方法 選取雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=10)、模型組(n=10)、美多芭組(n=20)和原兒茶酸組(n=20)。模型組、美多芭組和原兒茶酸組建立帕金森大鼠模型，美多芭組和原兒茶酸組大鼠分別給予相應(yīng)藥物治療，持續(xù)2周。治療結(jié)束后，對(duì)所有大鼠的血清TNF-α、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及IL-1β水平進(jìn)行檢測。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，模型組血清TNF-α、IL-1β、MDA水平明顯升高，而SOD水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，經(jīng)治療后美多芭組和原兒茶酸組血清TNF-α、IL-1β、MDA水平明顯降低，而SOD水平明顯升高(P<0.05)。美多芭組與原兒茶酸組血清TNF-α、IL-1β、MDA及SOD比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 原兒茶酸能夠明顯降低帕金森模型大鼠血清TNF-α、MDA及IL-1β水平，提高SOD活性，對(duì)帕金森病引起的氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用。

原兒茶酸；帕金森??；大鼠；腫瘤壞死因子-α；白介素1β；氧化應(yīng)激

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)又稱“震顫麻痹”、巴金森癥或柏金遜癥[1]，是常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，引起紋狀體多巴胺含量下降為主要的病理改變。容易引起肢體靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢步態(tài)障礙等表現(xiàn)。PD好發(fā)于老年人，有資料稱，目前全世界有大約450萬PD患者[2]，而我國有220萬的PD患者，預(yù)計(jì)到2030年將達(dá)到500萬。我國>60歲人群PD的患病率為1%，>65歲人群PD的患病率為1.7%左右，并且有逐年上升的趨勢[3]，因此，積極控制病情發(fā)展尤為重要。PD為慢性進(jìn)展性疾病，應(yīng)用左旋多巴類藥物替代治療是目前最主要的治療手段。但是，左旋多巴制劑容易引起“開”“關(guān)”現(xiàn)象、療效下降、運(yùn)動(dòng)功能障礙等副作用[4]，臨床療效并不理想，所以，有效安全的藥物成為研究的熱點(diǎn)。原兒茶酸是一種天然的活性成分，具有抗菌、祛痰、改善心肌缺氧，近年來發(fā)現(xiàn)還具有抗氧化、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等活性[5]，有研究顯示[6]，原兒茶酸能夠保護(hù)神經(jīng)元免受氧化損傷，防止神經(jīng)元凋亡。PD的發(fā)生也與氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷有關(guān)，然而，目前關(guān)于原兒茶酸治療PD的相關(guān)研究較少。因此，本研究通過建立帕金森大鼠模型，并對(duì)治療后各組大鼠血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物及白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)水平進(jìn)行檢測，來探討原兒茶酸對(duì)PD大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取SPF級(jí)成年雄性SD大鼠(由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào): SYXK(蘇) 2005-0018)60只，體質(zhì)量(210±20)g，周齡約6周。將所有大鼠置于鼠箱內(nèi)分別進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，維持室溫在20 ℃～25 ℃，濕度約55%，給予充足的飲水和標(biāo)準(zhǔn)飼料，讓其自由活動(dòng)與進(jìn)食，設(shè)定晝夜周期為12 h。本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 試劑：6-羥基多巴胺(6-OHDA，上海江萊生物科技有限公司)，水合氯醛(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，阿樸嗎啡(上海浩然生物技術(shù)有限公司)，多巴絲肼片(上海羅氏制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H10930198)；原兒茶酸(上海哈靈生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器：腦立體定位儀(51700系列，美國stoleting)；MB-602酶聯(lián)免疫分析儀(濟(jì)南普納儀器設(shè)備有限公司)；AU5400全自動(dòng)生化分析儀(OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1 造模及實(shí)驗(yàn)方法：所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只、模型組10只、美多芭組20只、原兒茶酸組20只。將6.7 mg 6-羥基多巴胺(6-OHDA)溶于1 mL含0.2%抗壞血酸的生理鹽水中，制成溶液(6.7 mg/mL)備用。對(duì)模型組、美多芭組和原兒茶酸組大鼠進(jìn)行造模，采用腹腔注射10%的水合氯醛(40 mL/100 g)進(jìn)行麻醉，麻醉成功后取仰臥位，將大鼠固定于腦立體定位儀上，定位左側(cè)紋狀體，鉆透顱骨，以1 μL/min的速度向左側(cè)紋狀體內(nèi)注射6-OHDA溶液，留針10 min后緩慢拔針，常規(guī)縫合傷口、抗感染。手術(shù)2周后，用0.9%NaCl配制濃度為0.05 mg/mL的阿樸嗎啡溶液，經(jīng)腹腔注射0.25 mg/kg，記錄大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，速度達(dá)到6 r/min即為造模成功[7]，本研究各組大鼠均造模成功。用0.9%NaCl配制濃度為40 mg/mL的美多芭溶液，美多芭組大鼠灌胃400 mg/kg美多芭，每天1次灌胃治療；用0.9%NaCl配制濃度為0.5 mg/mL的美多芭溶液，原兒茶酸組皮下注射原兒茶酸5 mg/kg，每天1次。模型組予以等體積0.9%NaCl。2組大鼠均治療2周。

1.2.2 血清指標(biāo)采集：治療結(jié)束后，分別采集各組大鼠的尾部靜脈血2 mL，然后分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中TNF-α、IL-1β水平，用酶標(biāo)儀分析；采用硫代巴比妥酸比色法測定血清中丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平及黃嘌呤氧化酶法測定血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平，用全自動(dòng)生化分析儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中TNF-α水平比較 模型組TNF-α水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。治療后美多芭組和原兒茶酸組血清TNF-α水平明顯低于模型組(P<0.05)，但仍顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。美多芭組和原兒茶酸組血清TNF-α水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組大鼠血清中TNF-α水平比較

*P<0.05，與正常對(duì)照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with mondel group

2.2 各組大鼠大鼠血清中IL-1β水平比較 模型組血清IL-1β水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。治療后美多芭組和原兒茶酸組血清IL-1β水平明顯低于模型組(P<0.05)，且與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。美多芭組和原兒茶酸組血清IL-1β水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組大鼠血清中IL-1β水平比較

*P<0.05，與正常對(duì)照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with mondel group

2.3 各組大鼠大鼠血清中MDA、SOD水平比較 模型組血清MDA水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，治療后美多芭組和原兒茶酸組MDA水平明顯低于模型組(P<0.05)，但仍顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。模型組血清SOD水平明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)，治療后美多芭組和原兒茶酸組血清SOD水平明顯高于模型組(P<0.05)，且與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。美多芭組和原兒茶酸組大鼠血清MDA、SOD水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 各組大鼠血清中MDA、SOD水平比較Tab.3 Comparison of serum MDA and SOD levels among each group (±s，mmol/L)

*P<0.05，與正常對(duì)照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with mondel group

3 討論

隨著社會(huì)老齡化的而不斷加深，作為一種退行性病變，PD患者的發(fā)病率不斷增加，威脅患者的生活質(zhì)量和生命健康。PD的病因有年齡老化、遺傳、環(huán)境因素、腦外傷、感染和免疫、氧化反應(yīng)異常等[8]，這些因素能夠?qū)е挛挥诖竽X黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元損傷、凋亡，多巴胺合成分泌量減少，紋狀體、中腦-皮質(zhì)系統(tǒng)、中腦-邊緣系統(tǒng)的多巴胺含量下降，引起運(yùn)動(dòng)功能障礙、智能、情感異常等相關(guān)臨床表現(xiàn)。原兒茶酸是3，4-二羥基苯甲酸，存在于益智仁、狗脊、桂枝、川芎等藥物中，具有多種生理活性[9]，不僅能夠抑制細(xì)菌、平喘、祛痰，還能夠抗血小板聚集、減少心肌耗氧、解毒，能夠通過組織線粒體膜電位的變化來減少活性氧產(chǎn)生，抑制氧化反應(yīng)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損傷。已有研究顯示[10]，原兒茶酸對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型小鼠的腦組織具有保護(hù)作用。在本實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)PD模型大鼠血清TNF-α、SOD、MDA及IL-1β等相關(guān)指標(biāo)的檢測，觀察原兒茶酸對(duì)于PD的作用效果及機(jī)制。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均明顯高于正常對(duì)照組，表明PD的發(fā)生與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。TNF-α、IL-1β都是炎癥反應(yīng)相關(guān)的重要細(xì)胞因子，TNF-α具有細(xì)胞毒性，在免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用；IL-1β在加重炎癥反應(yīng)的同時(shí)，還能促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞合成分泌一氧化氮，損害神經(jīng)元。有研究報(bào)道[11]，炎癥反應(yīng)機(jī)制可能參與對(duì)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷，這與TNF-α等細(xì)胞因子水平升高有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，美多芭組和原兒茶酸組大鼠的血清TNF-α、IL-1β水平明顯降低(P<0.05)，表明原兒茶酸能夠抑制PD患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)于神經(jīng)元的損傷。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是帕金森病形成的主要原因之一，氧化反應(yīng)能夠損傷神經(jīng)元細(xì)胞，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清MDA水平明顯較高，血清SOD水平明顯較低(P<0.05)。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，屬于不飽和脂肪酸，能夠促進(jìn)脂質(zhì)過氧化以及氧自由基的形成，加重氧化反應(yīng)，影響細(xì)胞代謝，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，血清MDA水平常用來反映機(jī)體的氧化反應(yīng)程度[12]；SOD是超氧化物歧化酶，能夠催化超氧化物陰離子自由基(O2-)還原，達(dá)到清除自由基，減輕氧化反應(yīng)的作用，其血清水平常用來評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力[13]。MDA水平升高，SOD水平下降提示PD患者抗氧化能力減弱。而與模型組比較，美多芭組和原兒茶酸組大鼠的血清MDA水平明顯降低，血清SOD水平明顯升高(P<0.05)，表明原兒茶酸能夠提高機(jī)體抗氧化能力，減輕氧化損傷。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)60例PD模型大鼠血清TNF-α、SOD、MDA及IL-1β水平的檢測結(jié)果進(jìn)行分析，證實(shí)了原兒茶酸能夠明顯降低帕金森模型大鼠血清TNF-α、MDA及IL-1β水平，提高SOD活性，對(duì)帕金森病引起的氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用。在下一步研究中，本課題組將進(jìn)行分子機(jī)制方面研究，為本實(shí)驗(yàn)所反映的現(xiàn)象做出進(jìn)一步論證和分析。

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(編校：王儼儼)

Effect of protocatechuic acid on serum TNF-α, IL-1β and oxidative stress products levels in Parkinson rats

ZHANG QiangΔ, LIU You, ZHANG Zhong-hai

(Department of Medical Genetics,College of Basic Medicine，Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, China)

ObjectiveTo explore the effect of protocatechuic acid on serum tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and oxidative stress products levels in Parkinson rats.Methods60 male SD rats were randomly divided into normal control group (n=10), model group (n=10), madopar group (n=20) and protocatechuic acid group (n=20). Rat model with Parkinson disease were builded in model group, madopar group and protocatechuic acid group. Madopar group and protocatechuic acid group were given corresponding drug with a consecutive treatment of two weeks. After treatment，the serum TNF-α,malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and IL-1β levels were detected in all groups.ResultsCompared with normal control group, the serum TNF-α, IL-1β and MDA levels in model group were significantly higher, and SOD level was lower (P<0.05). Compared with model group, the serum TNF-α, IL-1β and MDA levels in madopar group pre-treatment were significantly lower, and SOD level was higher (P<0.05). There were no significant difference of serum TNF-α, IL-1β, MDA and SOD levels between madopar group and protocatechuic acid group.ConclusionThe protocatechuic acid could significantly reduce the serum TNF-α, MDA and IL-1β levels in Parkinson model rats, enhance the activity of SOD, which has protective effect on oxidative stress injury induced by Parkinson disease.

protocatechuic acid; Parkinson disease; rat; tumor necrosis factor-α; interleukin-1β; oxidative stress

徐州醫(yī)學(xué)院優(yōu)秀人才科研啟動(dòng)基金(D2014004)

張強(qiáng)，男，博士，講師，研究方向：帕金森病，E-mail：drzhangqiangxz@163.com。

R742.5

A

1005-1678(2015)11-0037-03