李相怡　方曦　任皓威　程琳　張拓　付國(guó)紅　劉寧

摘 要 通過(guò)體外模擬新生兒消化道條件，用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法（MALDI-TOF/TOF）探究人乳β-酪蛋白消化后的多肽組。在離子源加速電壓為20 kV，激光波長(zhǎng)337 nm，激光頻率200 Hz，離子延遲提取時(shí)間330 ns，質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加2000次條件下，掃描質(zhì)量范圍m/z 500～ 5000的肽段。結(jié)果表明，消化后得到26個(gè)肽段，分子量集中在1000～4000 Da。與已知功能的肽段序列進(jìn)行對(duì)比，人乳β-酪蛋白在新生兒體外模型消化后未產(chǎn)生與已知功能的活性肽序列匹配的肽段，但發(fā)現(xiàn)9個(gè)肽前體，其中含4個(gè)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 （ACE）抑制肽前體，2個(gè)酪蛋白磷酸肽（CPP）前體，2個(gè)抗氧化肽前體，1個(gè)免疫活性肽前體，由酶切位點(diǎn)推測(cè)分析，肽前體可以繼續(xù)在蛋白酶作用下轉(zhuǎn)化為生物活性肽。

關(guān)鍵詞 β-酪蛋白； 新生兒； 體外消化； 多肽組； 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜

1 引 言

多肽組（Peptidome）是指器官、組織、細(xì)胞和體液中全部?jī)?nèi)源性多肽組分，包括生物體內(nèi)具有特殊功能的活性多肽和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的多肽【1～3】，多肽組學(xué)（peptidomics）研究的是多肽組的成分、功能、變化規(guī)律及其相關(guān)關(guān)系【2】，已應(yīng)用于人體體液多肽組分析【4，5】。人乳以富含多種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)以及活性肽等優(yōu)點(diǎn)被公認(rèn)是新生兒最好的食品，其中β-酪蛋白的含量為30%～35%【6～8】，是人乳中比重最大的酪蛋白【9，10】。本課題組在人乳β-酪蛋白（尤其是中國(guó)人乳β-酪蛋白）的鑒定和結(jié)構(gòu)功能方面已開(kāi)展了前期研究【11～13】。目前， 關(guān)于人乳β-酪蛋白的研究集中于對(duì)其消化產(chǎn)物的分離、鑒定和生物學(xué)功能方面【14～17】，還沒(méi)有針對(duì)人乳β-酪蛋白消化后多肽組學(xué)的報(bào)道，而研究人乳β-酪蛋白消化后的多肽組可以為日后研發(fā)更適合嬰幼兒的配方食品提供參考。嬰兒（≤12月齡）尤其是新生兒（≤28日齡）的消化系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，代謝旺盛，但蛋白酶活性很低，胃蛋白酶活性和分泌量與嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育的時(shí)間成正相關(guān)，而胰蛋白酶的活性以及分泌量在3～24月齡時(shí)也低于成年人【18，19】。本研究在普遍使用的嬰兒體外消化方法【20】基礎(chǔ)上，根據(jù)新生兒蛋白酶活性低的特點(diǎn)，建立了更適合研究新生兒體外消化的模型。以此模型消化人乳β-酪蛋白，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法分析其消化產(chǎn)物多肽組。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

GL-21M高速冷凍離心機(jī)（上海離心機(jī)械研究所）； Delta320型pH計(jì)和AL204精密電子天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）； 真空冷凍干燥機(jī)（上海醫(yī)用儀器廠）； DYY-10C型電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器）； 凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-RAD公司）； 蛋白質(zhì)純化儀AKTA purifer 100（美國(guó)GE公司）； AB4700 MALDI TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

DEAE-Sepharose Fast Flow葡聚糖凝膠（美國(guó)GE公司）； ziptip C18層析柱（美國(guó)GE公司）； 人乳采自中國(guó)漢族人乳； 胃蛋白酶、胰蛋白酶、尿素 （美國(guó)Sigma公司）； 預(yù)染蛋白Marker（美國(guó)Thermo scientific公司）； 30 %聚丙烯酰胺（北京Solarbio公司）； 兔抗人β-酪蛋白抗體（美國(guó)Abcam公司）； 增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒（Tiangen公司）。其它試劑均為分析純； 實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 人乳β-酪蛋白的純化與鑒定 參照文獻(xiàn)＼低以及酶添加量很少。但含9個(gè)肽前體（肽前體是在特定

環(huán)境下，經(jīng)蛋白酶消化可以轉(zhuǎn)化為生物活性肽的多肽），其中酪蛋白磷酸肽前體2個(gè)，抗氧化肽前體2個(gè)，ACE抑制肽前體4個(gè)，免疫活性肽前體1個(gè)，各種多肽的功能分布見(jiàn)圖4B。在圖4C中，根據(jù)存在的酶切位點(diǎn)推測(cè)肽前體可以在胃蛋白酶或者羧肽酶B等作用下轉(zhuǎn)化成活性肽（除黑色外，其它顏色的部分為活性肽序列），如第一個(gè)CPP前體可被蛋白酶K消化成CPP。

4 結(jié) 論

新生兒體外消化模型消化人乳β-酪蛋白，獲得人乳β-酪蛋白多肽組數(shù)據(jù)，模擬胃消化得到9個(gè)肽段，模擬小腸消化得到6個(gè)肽段，模擬胃腸連續(xù)消化得到11個(gè)肽段。實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)與已知功能活性肽序列匹配的肽段； 但發(fā)現(xiàn)有9個(gè)肽前體，其中CCP肽前體2個(gè)，抗氧化肽前體2個(gè)，ACE抑制肽前體4個(gè)，免疫活性肽前體1個(gè)，由酶切位點(diǎn)推測(cè)分析肽前體可以繼續(xù)在蛋白酶作用下轉(zhuǎn)化為生物活性肽。這些多肽可能具有促進(jìn)新生兒腸道菌群的建立及腸黏膜的發(fā)育等功能，具體的功能有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究。

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