齊 元, 姚義安

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200120)

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·基礎(chǔ)研究·

血管緊張素Ⅱ?qū)θ四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO和ET1的影響

齊 元, 姚義安

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200120)

目的 通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ )對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)分泌NO和ET1的影響，探討其可能的機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)HUVECs，對(duì)其進(jìn)行不同濃度Ang Ⅱ 刺激(1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L刺激組)，及相同濃度不同作用時(shí)間Ang Ⅱ 刺激(1×10-7mol/L刺激2、6、12、18、24h)，并應(yīng)用不同的受體阻斷劑(AT1R阻斷劑替米沙坦、AT2R阻斷劑PD123319)及信號(hào)通路阻斷劑(Erk1/2阻斷劑PD98059、P38 MAPK阻斷劑SB203580、PKC阻斷劑Staurosporine)觀察Ang Ⅱ 的作用通路，用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌的內(nèi)皮素1(ET1)，用Griess法檢測(cè)一氧化氮(NO)，用RT-PCR方法檢測(cè)eNOS/ET1 mRNA水平。結(jié)果 Ang Ⅱ 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用有濃度效應(yīng)，Ang Ⅱ 越高，eNOS mRNA表達(dá)和NO水平越低，而ET1 mRNA表達(dá)與蛋白水平越高；Ang Ⅱ 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響有時(shí)間效應(yīng)，Ang Ⅱ 作用時(shí)間越長(zhǎng)，NO/ET1水平越低；替米沙坦、PD98059和SB203580能阻斷Ang Ⅱ 的效應(yīng)；而PD123319和Staurosporine不能阻斷Ang Ⅱ 的效應(yīng)。結(jié)論 Ang Ⅱ 可損傷內(nèi)皮細(xì)胞的分泌功能，表現(xiàn)為NO降低而ET1升高，其通過AT1R發(fā)揮,用并可能通過Erk1/2及MAPK信號(hào)通路途徑起作用。

血管緊張素Ⅱ； 內(nèi)皮細(xì)胞功能； 信號(hào)通路

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是一個(gè)多層次的、各種因素和細(xì)胞成分相互影響的瀑布式發(fā)展過程。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化形成的決定性因素。近年來，研究[1]發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ )能誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙,導(dǎo)致內(nèi)皮素分泌增加，NO分泌減少，促進(jìn)血栓形成，參與動(dòng)脈粥樣硬化事件的發(fā)生發(fā)展，而替米沙坦等AT1受體阻斷劑可改善內(nèi)皮功能，但其作用途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不明確。

Ang Ⅱ 的受體主要有血管緊張素受體1(AT1R)和血管緊張素受體2(AT2R)，Ang Ⅱ 主要通過AT1R發(fā)揮生理效應(yīng)，替米沙坦是AT1R特異受體阻斷劑，而PD123319是AT2R特異阻斷劑。本實(shí)驗(yàn)通過研究Ang Ⅱ 對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO及ET1的影響，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行研究，進(jìn)而探討Ang Ⅱ 在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

健康新生兒臍帶取自同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院婦產(chǎn)科；Ⅰ型膠原酶、Angiotensin、PD123319、SB203580、PD98059、Staurosporine購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；替米沙坦購(gòu)自北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司；RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibcol公司；ET1試劑盒購(gòu)自R&D Systems公司，NO試劑盒購(gòu)自晶美生物技術(shù)有限公司；β-actin、eNOS及ET1引物購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；恒溫CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Revco公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自Forma Scientific公司；酶標(biāo)儀(CliniBio 128C型)購(gòu)自CliniBio公司；PTC200 PCR儀購(gòu)自O(shè)pticon公司；Coic倒置顯微鏡購(gòu)自重慶電子儀器廠。

1.2 HUVEC培養(yǎng)及鑒定

無菌取分娩4h內(nèi)健康新生兒臍帶，用PBS緩沖液沖洗干凈。以Ⅰ型膠原酶于37℃恒溫箱中消化15 min，加入M200培養(yǎng)基終止反應(yīng)，收集消化液，離心半徑10cm，1000r/min，離心5min，棄去上清液，收集細(xì)胞，加入M200培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，放入37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)所得HUVEC細(xì)胞形態(tài)學(xué)符合內(nèi)皮細(xì)胞特征(使用相差倒置顯微鏡觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài))，見圖1。選擇生長(zhǎng)良好的第2～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

圖1 原代HUVEC鏡下形態(tài)Fig.1 Cellular morphology of primary HUVEC under optical microscopyA(×10)： 原代HUVEC培養(yǎng)第2天，可見HUVEC從貼壁的細(xì)胞團(tuán)中向外生長(zhǎng)，呈多邊形，集落樣；B(×100)： 原代培養(yǎng)第2代，細(xì)胞呈圓形，鋪路石樣排列

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞長(zhǎng)至亞融合后,無血清同步6h，實(shí)驗(yàn)共分14組，其中包括對(duì)照組(培養(yǎng)基不加影響藥物)，相同濃度不同時(shí)間Ang Ⅱ刺激組[1×10-7mol/L濃度下分別刺激2、6、12、18及24h(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組)]，不同濃度Ang Ⅱ刺激組[1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L(Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組)]及經(jīng)過1×10-7mol/L Ang Ⅱ 預(yù)刺激0.5h后加入不同阻斷藥物作用組[1×10-5mol/L替米沙坦，1×10-7mol/L PD123319，1×10-7mol/L PD98059，1×10-7mol/L PD203580，1×10-7mol/L Staurosporine作用組(Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ、ⅩⅢ和ⅩⅣ組)](信號(hào)通路主要有ERK1/2、p38 MAPK、PKC途徑，其阻斷劑分別為PD98059、SB203580、Staurosporine)。

1.4 ELISA法測(cè)定NO及ET1

各組培養(yǎng)作用結(jié)束后收集細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作步驟進(jìn)行，用Clini Bio 128C型酶標(biāo)儀檢測(cè)NO及ET1水平。

1.5 RT-PCR檢測(cè)eNOS及ET1表達(dá)

收集細(xì)胞,TRIzol法提取總RNA,紫外分光光度計(jì)準(zhǔn)確定量其濃度和純度,所用RNA的A260/A280均為1.8～2.0,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。eNOS PCR擴(kuò)增引物序列： 正義鏈5′-GTTTGTCTG-CGGCGATGT-3′，反義鏈5′-GTGCGTATGCGGCT-TGTC-3′,退火溫度為58℃，ET1 PCR擴(kuò)增引物序列： 正義鏈5′-CGTGAGAATAGATGCCAATGTG-3′，反義鏈5′-ACCAATGTGCTCTCGGTTGTG-3′,退火溫度為56℃，β-actin引正義鏈5′-CGCACCA-CTGGCATTGTCAT-3′,反義鏈5′-TTCTCCTTGAT-GTCACGCAC-3′,退火溫度為57℃；然后以PCR擴(kuò)增目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,94℃變性2min后進(jìn)行以下循環(huán)： 94℃變性40s,退火40s,72℃延長(zhǎng)1min,循環(huán)34次,最后72℃延長(zhǎng)5min。取PCR產(chǎn)物10μl行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,溴乙錠染色后UVP凝膠成像系統(tǒng)掃描觀察攝影,以β-actin的吸光度作為內(nèi)參照,根據(jù)目的基因與內(nèi)參照電泳條帶點(diǎn)密度的比值進(jìn)行eNOS及ET1 mRNA表達(dá)水平的半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Ang Ⅱ?qū)O及ET1分泌的影響

2.1.1 不同濃度Ang Ⅱ?qū)O及ET1分泌的影響 Ang Ⅱ 濃度越高，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO、ET1及NO/ET1的影響越大，表現(xiàn)為隨著Ang Ⅱ濃度的增加NO的分泌減少，當(dāng)達(dá)到1×10-7mol/L時(shí)變化最大，NO及NO/ET1水平與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.1.2 相同濃度Ang Ⅱ不同時(shí)間對(duì)NO及ET1的影響 考慮到隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量也隨之增多，分泌的NO與ET1也會(huì)隨之增加，但NO/ET1是不受細(xì)胞數(shù)量的影響的，因此選擇NO/ET1進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 作用時(shí)間越長(zhǎng)，1×10-7mol/L Ang Ⅱ?qū)O/ET1的影響越顯著，表現(xiàn)為隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，NO/ET1顯著降低，以24h時(shí)變化最為顯著(P<0.05)，見表2。

表1 不同濃度Ang Ⅱ?qū)O及ET1分泌的影響

組別NO含量/(μmol·ml-1)ET1含量/(pg·ml-1)NO/ET1Ⅴ組64.17±3.7868.23±3.700.91±0.02Ⅵ組61.68±4.2869.56±6.970.89±0.004Ⅶ組61.06±3.7869.98±4.940.85±0.012Ⅷ組56.39±3.78*76.11±8.420.77±0.06*Ⅸ組52.34±4.28*80.41±8.52*0.68±0.047*

與對(duì)照組相比，*P<0.05

表2 相同濃度、不同時(shí)間Ang Ⅱ?qū)O及ET1的影響

組別NO含量/(μmol·ml-1)ET1含量/(pg·ml-1)NO/ET1Ⅰ組34.89±2.8641.92±1.070.87±0.05Ⅱ組40.81±2.8648.54±3.090.85±0.03Ⅲ組45.48±3.2858.34±4.920.81±0.03Ⅳ組47.35±3.0059.5±1.460.78±0.04Ⅴ組56.39±3.7876.11±8.420.77±0.06*

與2h相比，*P<0.05

2.1.3 Ang Ⅱ受體拮抗劑及3種信號(hào)通路阻斷劑對(duì)Ang Ⅱ作用于內(nèi)皮功能的影響 1×10-7mol/L Ang Ⅱ?qū)?nèi)皮細(xì)胞分泌的NO、ET1及NO/ET1均有影響，較對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而在替米沙坦、PD98059和SB203580分別與Ang Ⅱ的聯(lián)合作用組，其NO、ET1及NO/ET1與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在PD123319及Staurosporine分別與Ang Ⅱ的聯(lián)合作用組，與對(duì)照組相比，NO降低，ET1升高而NO/ET1降低(P<0.05)，見表3。提示AT1R可以阻斷血管緊張素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，而AT2R不能(P<0.05)；信號(hào)通路MAPK與ERK阻斷劑能阻斷其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，而PKC信號(hào)通路阻斷劑不能阻斷(P<0.05)。

表3 ATR受體阻斷劑及某些信號(hào)通路阻斷劑對(duì)血管緊張素作用的影響

組別NO含量/(μmol·ml-1)ET1含量/(pg·ml-1)NO/ET1Ⅴ組64.17±3.7868.23±3.700.91±0.02Ⅷ組56.39±3.78*76.11±8.42*0.77±0.06*Ⅹ組63.23±3.5471.47±2.800.90±0.03Ⅺ組55.76±1.95*75.36±4.09*0.75±0.04*Ⅻ組64.49±3.3769.36±0.280.90±0.02ⅩⅢ組65.42±2.4770.55±4.090.91±0.04ⅩⅣ組54.85±3.89*74.73±2.810.76±0.04*

與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.2 不同Ang Ⅱ刺激后內(nèi)皮細(xì)胞RT-PCR結(jié)果

隨著濃度的升高，Ang Ⅱ的刺激會(huì)導(dǎo)致eNOS降低、ET1升高和eNOS/ET1降低；而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，相同濃度的Ang Ⅱ刺激會(huì)導(dǎo)致eNOS進(jìn)一步降低，ET1進(jìn)一步升高和eNOS/ET1進(jìn)一步降低。替米沙坦、SB203580和PD98059分別聯(lián)合Ang Ⅱ刺激后，RT-PCR結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PD123319和Staurosporine單獨(dú)聯(lián)合Ang Ⅱ刺激后，eNOS降低、ET1升高和eNOS/ET1降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、表4～6。

圖2 各組RT-PCR結(jié)果Fig.2 RT-PCR results in different groups

表4 不同濃度Ang Ⅱ?qū)?nèi)皮細(xì)胞eNOS、ET1 mRNA 表達(dá)的影響

組別eNOS/actin值ET1/actin值eNOS/ET1值Ⅴ組0.81±0.070.77±0.061.05±0.07Ⅵ組0.76±0.070.79±0.040.97±0.06Ⅶ組0.74±0.060.81±0.030.91±0.06Ⅷ組0.69±0.05*0.87±0.06*0.79±0.06*Ⅸ組0.64±0.03*0.88±0.10*0.73±0.08*

與對(duì)照組相比，*P<0.05

表5 不同時(shí)間Ang Ⅱ?qū)?nèi)皮細(xì)胞eNOS、ET1 mRNA表達(dá)的影響

組別eNOS/actin值ET1/actin值eNOS/ET1值Ⅰ組0.80±0.080.79±0.081.01±0.10Ⅱ組0.78±0.080.82±0.070.95±0.08Ⅲ組0.76±0.080.85±0.060.89±0.07Ⅳ組0.74±0.07*0.87±0.09*0.85±0.07*Ⅷ組0.69±0.05*0.87±0.06*0.79±0.06*

與2h相比，*P<0.05

表6 ATR及不同信號(hào)通路阻斷劑對(duì)Ang Ⅱ作用后的內(nèi)皮細(xì)胞eNOS、ET1 mRNA表達(dá)的影響

組別eNOS/actin值ET1/actin值eNOS/ET1值Ⅴ組0.81±0.070.77±0.061.05±0.07Ⅷ組0.69±0.05*0.87±0.06*0.79±0.06*Ⅹ組0.80±0.070.76±0.041.05±0.05Ⅺ組0.68±0.07*0.86±0.09*0.80±0.06*Ⅻ組0.79±0.080.74±0.051.06±0.12ⅩⅢ組0.80±0.110.77±0.091.04±0.1ⅩⅣ組0.68±0.08*0.83±0.1*0.82±0.04*

與24h相比，*P<0.05

3 討 論

Ang Ⅱ是一種重要的血管收縮劑，可誘導(dǎo)醛固酮的分泌，保鈉保水，增加循環(huán)血容量和維持正常血壓。Ang Ⅱ不僅可以調(diào)節(jié)血壓，還可以誘導(dǎo)重要的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，與動(dòng)脈粥樣硬化和急性冠脈綜合征密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，Ang Ⅱ可顯著抑制HUVEC eNOS mRNA的表達(dá)，進(jìn)而抑制NO的分泌。Ang Ⅱ?qū)NOS的抑制作用呈劑量依賴性，在生理濃度(1×10-9mol/L)時(shí)即對(duì)eNOS的表達(dá)有抑制作用，這種作用在1×10-6mol/L時(shí)最明顯，但是在1×10-7mol/L時(shí)變化最為明顯。另一方面，Ang Ⅱ還可顯著上調(diào)ET1 mRNA水平，使ET1的蛋白水平相應(yīng)增加。同樣，這種作用也存在劑量依賴性。這兩種作用的結(jié)果導(dǎo)致NO/ET1的平衡失調(diào)，顯著降低。本研究與國(guó)內(nèi)外大部分研究[2- 3]結(jié)果相似，但與個(gè)別研究[4]不一致，其認(rèn)為Ang Ⅱ是通過AT2R增加內(nèi)皮細(xì)胞NO的分泌。本研究與之不同之處在于，在研究[5]中，Ang Ⅱ作用時(shí)間較短，僅15min左右即觀察結(jié)果，而本研究中，作用時(shí)間為2～24h，增加了實(shí)驗(yàn)的整體可靠性和準(zhǔn)確性。在血管系統(tǒng)中，AT1R主要在血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)，參與血管的收縮、增殖和促炎作用[5]，在內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)氧化LDL受體表達(dá)與活性氧的產(chǎn)生[6]。而AT2R的作用與AT1R相反，多表現(xiàn)為保護(hù)性作用。AT2R的作用時(shí)間較短，起效較快，而AT1R作用時(shí)間長(zhǎng)，起效較慢。雖有研究認(rèn)為Ang Ⅱ是通過AT2R增加內(nèi)皮細(xì)胞NO的分泌，但由于本研究作用時(shí)間較長(zhǎng)，Ang Ⅱ通過AT1R產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)增多抵消了通過AT2R產(chǎn)生的NO升高。且本研究阻斷AT1R后，Ang Ⅱ誘導(dǎo)的NO降低作用消失也說明了這點(diǎn)。另一些研究也表明，AT1R阻斷劑可改善內(nèi)皮功能，這與本研究結(jié)果相一致，提示Ang Ⅱ受體阻斷劑可改善內(nèi)皮功能，也為沙坦類藥物應(yīng)用于冠心病患者奠定了基礎(chǔ)。

國(guó)外研究[7-8]表明，AT1R是一個(gè)G蛋白耦聯(lián)受體，能激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，如PKC、MAPK及酪蛋白激酶等發(fā)揮生理作用。MAPK信號(hào)通路能活化轉(zhuǎn)錄因子2、心肌增強(qiáng)因子2C及NF-κB等，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化與凋亡，引起細(xì)胞功能的變化，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[9]。本研究還表明，阻斷MAPK的信號(hào)通路ERK1/2或p38MAPK后，Ang Ⅱ的作用則被抑制，而阻斷PKC信號(hào)通路Ang Ⅱ的作用仍然存在，這提示Ang Ⅱ可能是通過MAPK信號(hào)通路發(fā)揮其降低eNOS和ET1分泌作用的。當(dāng)然，這只是一個(gè)初步的結(jié)果，還需要進(jìn)一步檢測(cè)其內(nèi)在的MAPK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)量來證實(shí)。

本研究結(jié)果表明AT1R阻斷劑替米沙坦能有效阻斷Ang Ⅱ的作用，升高NO，降低ET1，并使eNOS的mRNA表達(dá)增加而ET1 mRNA表達(dá)降低，且阻斷MAPK信號(hào)通路也能阻斷Ang Ⅱ的效應(yīng)。這些結(jié)果提示我們，替米沙坦能阻斷Ang Ⅱ通路，改善內(nèi)皮功能，是治療冠心病的有效藥物之一。

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Effects of angiotensin Ⅱ on secretion of NO and ET1 in cultured human umbilical vein endothelial cells

QIYuan,YAOYi-an

(Dept. of Cardiology, East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China)

Objective To investigate the effects of angiotensin Ⅱ(Ang Ⅱ) on secretion of nitric oxide (NO) and endothelin 1(ET1) in cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and the underlying mechanisms. Methods HUVECs were treated with Ang Ⅱ in different concentrations (1×10-9，1×10-8，1×10-7，1×10-6mol/L) or same concentration for different lengths of time (1×10-7mol/L for 2,6,12,18 and 24h), with or without Ang Ⅱ type 1 receptor (AT1R) blocker Telmisartan, Ang Ⅱ type 2 receptor (AT2R) blocker PD123319, or different kinase inhibitors PD98059(inhibitor of ERK1/2 MAP kinase), SB203580(inhibitor of ERK1/2 MAP kinase) and Staurosporine (phosphatidylinositol 3-kinase). Endothelin1(ET1) and NO in the medium were measured by ELISA and Griess reagent, respectively; and eNOS/ET1 mRNA expression was measured by RT-PCR. Results Ang Ⅱ up-regulated ET-1 protein level and down-regulated NO concentration, and decrease the NO/ET1 ratio in HUVECs in a dose-and time-dependent manner within 24h. Telmisartan, PD98059 and SB203580 blocked this effect, but PD123319 and Staurosporine had no blockage effect. Conclusion Ang Ⅱ can decrease the level of NO and increase the level of ET1, this effect were partly through AT1R and MAPK and Erk1/2 signal cell pathway.

angiotensin Ⅱ； endothelial cell function; cell signal pathway

10.16118/j.1008-0392.2015.01.006

2014-02-17

齊 元(1986—)，女，碩士研究生.E-mail： qiyuanqifang929@126.com

姚義安.E-mail： yaoyian2004@126.com

R 543.5

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1008-0392(2015)01-0024-05