李雪巖，黃 亮，劉 剛，尹洪娜△，孫忠人

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱150040)

腦部出血后，腦血腫會很快形成，由于血腫的不斷刺激，引起出血點周圍壓力增加，導致細胞出現(xiàn)代謝障礙。更多的實驗表明:在腦出血的初步階段，血管通透性增強，進而引起腦細胞水腫。為了解決這一難題，導師在臨床中用本法治療腦出血患者，收到較好療效，針刺可以激活受傷的腦細胞，促進神經(jīng)細胞進一步的分化自救，并且針刺具有促進腦內(nèi)大部分血腫吸收、減輕腦水腫的相關(guān)作用［1］。IL-6 作為一種促炎癥介質(zhì)，伴隨出血參與發(fā)病的全過程。因此本研究通過觀察分析百會透懸厘針刺法對腦出血急性期模型大鼠腦組織中白細胞介素-6 表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

Wistar 大鼠(健康、清潔級、雄性)80 只，每只(280 ±10)g。

1.2 設(shè)備

①數(shù)碼相機Japan;②自動脫水機XGQ-15/20 泰州世紀康峰機電制造有限公司;③微量注射器;④生物組織包埋機KH-BL，湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司;⑤307-6 型臺式牙鉆機，中國上海齒科醫(yī)械廠;⑥石蠟切片機LEICA RM 2135，中國天津航空機電公司;⑦電熱恒溫箱;⑧展片機TEC-2601 型 常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司;⑨烤片機PPTHK-21B，上海精密儀器儀表有限公司;○10恒溫低溫冰箱;○1電子天平FA1004N，鄭州時代儀器設(shè)備有限公司;○12病理圖像分析系統(tǒng)JD801，江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司;○13Motic image 3.2 圖像分析軟件，Motic 公司生產(chǎn)○14立體定位儀ZH-藍星B 型，中國安徽儀器廠。

1.3 試劑

①PV-6001 二步法免疫組化檢測試劑，北京中杉金橋生物有限;②IL-6 免疫組化試劑盒，武漢博士德生物有限公司;③DAB 顯色試劑盒，天津百浩生物科技有限公司;④多聚賴氨酸，廣州市一科生物有限公司;⑤Na2HPO4·12H2O，分析純，北京康普匯維科技有限公司;⑥多聚甲醛，分析純，北京康普匯維科技有限公司;⑦NaCl，分析純，廣州市一科生物有限公司;⑧NaH2PO4·2H2O，分析純 北京康普匯維科技有限公司。

1.4 實驗動物分組

將80 只大鼠，隨機取8 只為A 組，剩余72 只造模成功后，隨機分為B 組、C 組、D 組各24 只，分為2 天、7 天、14 天時間段，每段8 只大鼠。C 組與D 組于造模成功6 h 后，給予相應的藥物與針刺治療，然后在對應的2 天、7 天、14 天時間段停止治療，先給予神經(jīng)功能學評分，之后取材。

A 組(對照組):不做手術(shù)處理，斷頭取材。

B 組(模型組):造模后2 天、7 天、14 天分別先給予神經(jīng)功能學評分，然后取材。

C 組(西藥組):造模成功6 h 后，給予腦活素稀釋液灌胃(按人:大鼠體重為200∶1 配置)。2 天組連續(xù)灌胃2 天，1 ml tidpo;7 天、14 天同上，于各時間點后先給予神經(jīng)功能學評分，然后取材。

D 組(針刺組):造模成功6 h 后，針刺病灶側(cè)百會穴透懸厘穴，取穴方法參照華興邦等制定的《實驗動物穴位圖譜》，留針30 min，期間捻轉(zhuǎn)1 次，時長控制在1 min，頻率為200 轉(zhuǎn)/min。針刺治療2 天、7 天、14 天后，先給予神經(jīng)功能學評分，然后取材。

1.5 腦出血模型的制備

首先確定尾殼核位置。采用腦內(nèi)靶向注射膠原酶誘發(fā)大鼠ICH 模型。定點定位后，用牙科鉆鉆直徑為1.0 mm 的圓孔，深達硬腦膜表面，將微量注射器固定于立體定位儀上，沿鉆孔垂直進針約6 mm，用自動推進器按每只0.8 U(0.1 U/μL)膠原酶Ⅶ，以1 μL/min的速度緩慢勻速注入右側(cè)尾狀核，緩慢出針。縫合頭皮，局部皮膚采用碘酚消毒，防止局部感染影響指標觀察。

1.6 標本取材

麻醉，暴露心臟，左心室插管，抵達升主動脈根部，于右心耳剪0.2 cm 口做出口。將9%氯化鈉200 ml灌注，等到流出的變清澈，換100 ml 的4%多聚甲醛灌注，等到標本變硬。斷頭取腦，切片、固定、脫水、浸蠟、包埋制成石蠟切片，用于相關(guān)檢測。

1.7 行為學的觀察

成功造模后，做好保溫，即于2 天、7 天、14 天評價神經(jīng)功能缺損，根據(jù)Berderson 神經(jīng)功能體征評分方法:帶好防護手套，提起鼠的尾巴懸至高于桌面20 ～25 cm 位置，記錄前肢病后體位。正常大鼠雙側(cè)前肢向下伸直，無神經(jīng)功能缺損-0 分;腦病灶對側(cè)前肢肩部、腕部、肘部屈曲并內(nèi)收-1 分;1 分體征+推大鼠向癱瘓側(cè)時阻力下降-2 分;2 分體征+自發(fā)性旋轉(zhuǎn)-3 分。

1.8 HE 染色

石蠟切片;脫蠟相關(guān)水化;經(jīng)過蘇木精后，流水沖;分化后，流水沖;返蘭后，水洗并浸泡;染色，脫水，經(jīng)透明，后封片。

1.9 IL-6 免疫組織化學檢測

①切片脫蠟;②放在30%H202 溶液中孵育8 min，PBS 洗5 min3 次;③熱抗原修復;④滴加血清封閉液;⑤滴加一抗;⑥滴加化二抗工作液;⑦DAB 顯色;⑧蘇木素復染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀測。

1.10 IL-6 蛋白表達

胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色小顆粒，細胞核有部分著色。

1.11 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。各實驗組間的兩兩比較采用t檢驗，以P ＜0.05 為有顯著差異，以P ＜0.01 為有極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分比較

針刺和西藥治療均能減少神經(jīng)功能缺損評分。造模后3 個時間點，D 組與B 組比較有顯著性差異(P ＜0.01)，D 組與C 組比較有明顯差異(P ＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能學評分(±s)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能學評分(±s)

注:與B 組比較，* P ＜0.05，△P ＜0.01;與C 組比較，●P ＜0.05。

組別 n 造模后2 天 7 天 14 天B 組造模前24 0 1.51±0.49 2.66±0.45 2.34±0.46 C 組 24 0 1.34±0.47 2.16±0.69 1.65±0.46*D 組 24 0 1.15±0.37 1.34±0.46△● 1.18±0.38△

2.2 腦組織IL-6 陽性細胞平均灰度值比較

大鼠腦組織中IL-6 檢測的陽性細胞平均灰度值，在造模后3 個時間點，D 組與B 組比較有顯著性差異(P ＜0. 01)，D 組和C 組兩者結(jié)果有差異(P ＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠IL-6 陽性細胞平均灰度值比較(±s)

表2 各組大鼠IL-6 陽性細胞平均灰度值比較(±s)

注:與A 組比較，＊P ＜0.05;與B 組比較，* P ＜0.05，△P ＜0.01;與C 組比較，●P ＜0.05。

組別 n 2 天 7 天 14天8 166.50±4.29 166.50±4.29 166.50±4.29 B 組 24 179.57±8.34＊ 178.21±5.78＊ 174.51±3.62＊C 組 24 179.68±2.95 177.86±7.01 171.52±3.71*D 組 24 171.85±4.93 170.21±3.51△● 163.83±4.41 A 組△●

3 討論

近年來，針灸治療腦出血的研究從臨床應用向基礎(chǔ)研究發(fā)展，通過不同視角、不同的研究手段，揭示針刺治療腦出血的作用機理。廣大學者充分運用現(xiàn)代理化等不同的方式方法，通過動物實驗模型復制等不同方面對頭穴針刺治療中風的作用機理予以深入的研究探討。在前人研究的基礎(chǔ)上，筆者再次進一步的研究了腦出血與運動功能及腦水腫與炎性因子的變化關(guān)系，以提供更好的臨床治療方法為更多的病患解決病痛。

腦出血后細胞因子表達主要包括NF-κB、IL-6、TNF-α、IL-8 和IL-1 等。IL-6 是一種調(diào)節(jié)炎癥和參與免疫反應有關(guān)的重要細胞成員，它主要由內(nèi)皮cell、成纖維cell、T-cell、單核巨噬cell、B-cell 等在外因作用下產(chǎn)生的糖蛋白，那么IL-6 被認為是促炎癥介質(zhì)之一，對多種細胞都有一定的影響，其生物學活性也較廣泛，特別是在腦出血后IL-6 能夠調(diào)節(jié)炎癥反應中的中性粒細胞功能，直接參與腦損傷。并與多種因子有協(xié)同或加強的作用，比如TNF 和IL-1 等。

在腦內(nèi)，IL-6 由多種細胞分泌比如神經(jīng)元細胞、血管內(nèi)皮細、神經(jīng)膠質(zhì)細胞，而其中主要來源為神經(jīng)膠質(zhì)細胞，其主要作用是調(diào)控炎癥反應，從而起到營養(yǎng)和保護神經(jīng)細胞的作用。另外IL-1 是一種致炎因子，而IL-6 能夠抑制其合成，從而使神經(jīng)元損傷減輕，這也就說明IL-6 能起到抗炎和抑制免疫反應的多方面作用。所以，通過實驗IL-6 水平表達增高，表明其參與了腦出血后的細胞損傷或修復。

周爽等［2］研究表明檢測到IL-6 過度表達時，說明神經(jīng)元細胞此時已有損傷，腦出血后釋放各種炎癥介質(zhì)，過多的IL-6 刺激細胞表達白細胞粘附分子，使白細胞向損傷區(qū)浸潤，與此同時損傷區(qū)TNF、IL- α、IL-8 合成，形成出血后損傷［3］。另一方面部分分子的粘附性增強，進而導致微血管的阻塞，這樣補體系統(tǒng)被激活，產(chǎn)生毒性細胞，破壞現(xiàn)有的細胞成分。這一事實會導致鏈式反應，使病損灶周圍血管收縮功能、通透性下降而引起腦水腫。而水腫帶的形成，又會向外擴張，壓迫周圍的及鄰近的腦組織，產(chǎn)生對應的功能區(qū)的損傷。

神經(jīng)功能缺損的量化評定與血清中IL-6 濃度的關(guān)系是正相關(guān)的，為研究提供了很好的理論依據(jù)。劉丹等［4］研究進一步證明這一觀點，并再次指出血清中IL-6 表達與出血量的多少、缺損的神經(jīng)功能程度表現(xiàn)為正相對應關(guān)系，可以更進一步解釋為:出血多IL-6表達高，出血少IL-6 表達低;則功能缺損重，其血清中IL-6 表達水平高于運動功能缺損程度輕的。同樣腦水腫程度越嚴重，其血清中IL-6 濃度相對也高，所以根據(jù)血清中IL-6 的表達水平可以推測其預后情況。

李麗［5］、于洋［6］通過實驗也證明血清中IL-6 的動態(tài)變化:出血量越多，其預后效果相對較差，而出血量越少，其預后效果相對較好。肖家平［7］提供藥物早期干預治療后，減輕了腦水腫的程度，降低了血清中IL-6 的表達，同時清除了自由基，保護了腦細胞。周汝娟等［8］通過相關(guān)實驗表明:當血清中檢測出IL-6過高表達時，其腦水腫程度較重，而引起血管再次出血的可能性也較大。吳濤［9］同樣也通過實驗證明在腦出血早期，血清中的IL-6 是成上升狀態(tài)的，隨著藥物的治療，血清中的IL-6 濃度控制在一定水平，然后逐漸下降，進而控制了感染，降低了腦水腫，改善了腦功能?，F(xiàn)在IL-6 的測定不僅在基礎(chǔ)實驗中，而且也已應用于臨床。研究已表明:IL-6 參與腦血管疾病恢復過程，為預后判斷提供了重要依據(jù)。

導師在臨床用本法治療腦出血患者眾多，同時也收到了較好的治療效果，故通過這次基礎(chǔ)實驗研究來進一步提供理論依據(jù)支持。本實驗說明“百會透懸厘”針刺法可以:①減輕神經(jīng)功能缺損程度;②保護急性期腦出血中受損的細胞。針刺治療中風病歷史悠久，在臨床實踐中效果突出。腦出血后通過少針透刺治療是未來的趨勢，更是研究的方向，希望更多的專家、學者加入進來，為本療法提供更多的臨床和基礎(chǔ)研究依據(jù)。

［1］ 石學敏.中風病與醒腦開竅針刺法［M］.天津:天津科學技術(shù)出版社，1998:323-325

［2］ 周爽，方邦江，黃建華.電針對高血壓性腦出血大鼠海馬GiZ、Gi3基因轉(zhuǎn)錄的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2005，11(6):437-439

［3］ 紀曉軍，何對，溫兆霞，等. 頭穴針刺對大鼠急性期腦出血血腦屏障影響的實驗研究［J］.中國急救醫(yī)學，2001，21(11):624

［4］ 劉丹，楊巧蓮，張紅宇，等.急性腦出血患者血清IL-6 和TGF-β1 含量變化及臨床意義［J］. 卒中與神經(jīng)疾病，2004，6(11):156-158

［5］ 李麗.急性腦出血患者血清TNF-ɑ、IL-6、No 的動態(tài)監(jiān)測及臨床意義［J］.中國醫(yī)師雜志，2003，5(12):1711-1712

［6］ 于洋.腦出血患者出血量與腦脊液中白介素-6 的關(guān)系［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2009，47(9):20-21

［7］ 肖家平.依達拉奉對腦出血患者血清白介素-6 和基質(zhì)金屬蛋白酶-9 水平的影響及療效分析［J］.中國當代醫(yī)藥，2010，17(17):29-31

［8］ 周汝娟，何龍錦，楊峰.血清白介素-6 和腫瘤壞死因子-α 與腦出血早期再出血的關(guān)系［J］.蚌埠醫(yī)學院學報，2010，35(11):28-29

［9］ 吳濤.腦出血患者使用醒腦靜注射液后血漿白介素-6 和腫瘤壞死因子-α 濃度的變化研究［J］. 藥物與臨床，2012，9(15):23-24