祝國(guó)富， 林 瑩， 李偉明

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200072)

?

·基礎(chǔ)研究·

Vaspin對(duì)巨噬細(xì)胞THP-1向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)變的抑制作用

祝國(guó)富， 林 瑩， 李偉明

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200072)

目的 腹腔脂肪型絲氨酸蛋白酶抑制劑(visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor, vaspin)是新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子,對(duì)代謝性疾病具有改善作用。該研究旨在研究vaspin對(duì)體外培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞泡沫化的影響。方法 100nM佛波酯孵育THP-1巨噬細(xì)胞48h后分為對(duì)照組，氧化低密度脂蛋白組(ox-LDL濃度50μg/ml,48h)，vaspin干預(yù)組(vaspin終濃度100ng/ml,預(yù)孵24h)；采用油紅0染色法檢測(cè)vaspin對(duì)THP-1細(xì)胞泡沫化的影響;Real-time PCR和Western blot法檢測(cè)vaspin對(duì)THP-1細(xì)胞中酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-1(acy1-coenzyme A: cholesterol acyltrasferase-1，ACAT-1)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP binding casstte transporterA1，ABCA1)及細(xì)胞清道夫受體-A1(scavenger receptor-A1， SR-A1)mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果 與ox-LDL組比較，ox-LDL+vaspin組巨噬細(xì)胞泡沫化程度明顯下降(P<0.05);ox-LDL+vaspin組ACAT-1和SR-A1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而ABCA1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 vaspin 能夠抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis， As)的作用。

腹腔脂肪型絲氨酸蛋白酶抑制劑； 巨噬細(xì)胞； 泡沫細(xì)胞； ?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-1； ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1； 細(xì)胞清道夫受體-A1

腹腔脂肪型絲氨酸蛋白酶抑制劑(vaspin)是2005年，從2型糖尿病肥胖大鼠模型中分離出的一種新型的脂肪因子，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。許多研究結(jié)果顯示,vaspin在代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,vaspin表達(dá)上調(diào)可以改善胰島素抵抗，并抑制炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[1-3]。

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis， As)是一種慢性炎癥性疾病，巨噬細(xì)胞吞噬氧化低密度脂蛋白(oxygenized-low density lipoprotein， ox-LDL)從而轉(zhuǎn)換成泡沫細(xì)胞是As形成的重要原因[4]。

Vaspin對(duì)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞中作用尚未明確。本實(shí)驗(yàn)用vaspin作用于單核巨噬細(xì)胞THP-1，研究其能否通過(guò)巨噬細(xì)胞內(nèi)與膽固醇代謝相關(guān)的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP binding casstte transporterA1， ABCA-1)、?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-1(acyl-coenzyme A: cholesterolacyhrasferase-1， ACAT-1)及細(xì)胞清道夫受體-A1(scavenger receptor-A1，SR-A1)基因的表達(dá)從而抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人單核巨噬細(xì)胞THP-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑

重組人腹腔脂肪型絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白購(gòu)自韓國(guó)Adipogen公司；ox-LDL購(gòu)自北京生物技術(shù)公司；胎牛血清、胰蛋白酶、DMSO及RPMI 1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PMA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗人ACAT-1、ABCA1及SR-A1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)SentaCrus公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自上海飛捷生物技術(shù)公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

1.4 vaspin對(duì)THP-1泡沫化影響的檢測(cè)

采用油紅O染色法。將各組貼壁的THP-1細(xì)胞用PBS洗滌3次，置于4℃，10%甲醛中固定 10min；PBS洗滌3次，于60%異丙醇中放置 5min；過(guò)濾后的油紅0染色10min；于60%異丙醇分化 5min；PBS洗滌，照相。

1.5 vaspin對(duì)THP-1細(xì)胞中ACAT-1、ABCA1及SR-A1基因mRNA水平影響的檢測(cè)

采用Real-time PCR法。ACAT-1基因引物forward: 5′-GGAACACAGCATGTCAGTGCAA-3′,re-verse: 5′-TGTCACTCCAGGGCGTACAATC-3′;ABC-A1基因引物: forward: 5′-AGCTAAGTCCCTGCA-CCACGA-3′,reve-rse: 5′-TGTACAATCACCGACCT-TGACCA-3′;SR-A1基因引物: forward;5′-GACT-CTGGAATATCCCAGGACAACA-3′,reve-rse: 5′-CTGAGGTTTGCTGCATCGACA-3′；內(nèi)參β-actin基因引物: forward: 5′-CCAAATGCAAACTGGATGA-TGAC-3′,reverse: 5′-CTCTTGTTGATTTGGGCAC-AGAC-3′。引物由賽百勝生物工程(上海)有限公司合成。收集各組細(xì)胞，提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min；95℃放置30s,60℃放置30s，72℃延伸1min,共40個(gè)循環(huán)。

1.6 vaspin對(duì)THP-1細(xì)胞中ACAT-1、ABCA1及SR-A1蛋白表達(dá)影響的檢測(cè)

采用Western blot法檢測(cè)。收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液裂解30min，將6孔板置于冰上提取細(xì)胞蛋白，提取后用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20μg蛋白，經(jīng)8%SDS-PAGE膠分離后，電轉(zhuǎn)至NC膜，以5%BSA于4SDS℃封閉1h；分別加入兔抗人ACAT-1、ABCA1及SR-A1多克隆抗體(均1∶500稀釋)，4℃濕盒中孵育過(guò)夜；復(fù)溫1h后，PBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶500稀釋)，37℃避光孵育1h，避光洗膜3次，每次10min，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，凝膠成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，兩樣本的均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 vaspin能夠抑制巨噬細(xì)胞的吞脂

油紅O染色結(jié)果顯示，對(duì)照組及ox-LDL組可見(jiàn)較多的油紅O染色陽(yáng)性脂滴，結(jié)果以脂滴面積占細(xì)胞總面積的百分比表示，圖中結(jié)果顯示vaspin預(yù)處理后，巨噬細(xì)胞中的脂滴形成明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 Vaspin對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響(油紅O染色，×200)Fig.1 Effect of vaspin on the bubbing of macrophages(oil red O staining,×200)

2.2 vaspin對(duì)THP-1細(xì)胞中ACAT-1、ABCA1及SR-A1基因mRNA水平的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，ox-LDL組較對(duì)照組ACAT-1及SR-A1基因mRNA水平明顯升高(P值都<0.05)，而ABCA1表達(dá)水平降低(P<0.05)；vaspin預(yù)處理組較ox-LDL組ACAT-1及SR-A1基因mRNA水平明顯降低(P分別<0.05)，而ABCA1表達(dá)水平升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 三組THP-1細(xì)胞中ACTA-1、SR-A1和ABCA1基因mRNA水平Fig.2 Levels of ACTA-1,SR-A1 and ABCA1 mRNAs in the THP-1 cells of three groups

2.3 vaspin對(duì)THP-1細(xì)胞中ACAT-1、ABCA1及SR-A1蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，ox-LDL組較對(duì)照組ACAT-1及SR-A1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P分別<0.05)，而ABCA1表達(dá)水平降低(P<0.05)；vaspin預(yù)處理組較ox-LDL組ACAT-1及SR-A1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而ABCA1表達(dá)水平升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 三組THP-1細(xì)胞中ACTA-1、SR-A1和ABCA1的蛋白表達(dá)水平Fig.3 Expressions levels of ACTA-1, SR-A1 and ABCA1 proteins in the THP-1 cells of three groups

3 討 論

研究表明在頸動(dòng)脈硬化的患者,有癥狀者較無(wú)癥狀者血清vaspin濃度降低[5],主動(dòng)脈周圍脂肪組織中vaspin水平與大動(dòng)脈硬化呈正相關(guān)。此外,在希臘人和現(xiàn)研究中發(fā)現(xiàn)冠心病患者的vaspin血清濃度較正常人低,且與冠心病嚴(yán)重程度相關(guān)[6]。

巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變的泡沫細(xì)胞是As形成的早期標(biāo)志，巨噬細(xì)胞能吞噬ox-LDL以及被自身細(xì)胞核金屬離子修飾的LDL,表現(xiàn)出一定的泡沫化傾向。通過(guò)清道夫受體,CD36受體或其他受體的作用,大量吞噬ox-LDL的巨噬細(xì)胞進(jìn)一步促成泡沫細(xì)胞的形成[7]。

ABCA1利用ATP為能量來(lái)源將細(xì)胞內(nèi)磷脂和游離膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至載脂蛋白A-1，啟動(dòng)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，清除多余脂質(zhì)尤其是細(xì)胞內(nèi)膽固醇的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。而ABCA1的降低導(dǎo)致血漿HDL的降低，引起造成脂質(zhì)的堆積，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成[8-9]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與ox-LDL組相比vaspin+ox-LDL組油紅O染色陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少，而ABCA1的基因和蛋白表達(dá)都顯著增加(P<0.05),表面vaspin可能通過(guò)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)而抑制巨噬細(xì)胞泡沫化。

SR-A是一種跨膜糖蛋白受體,主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)AS的發(fā)生、發(fā)展。由于不受細(xì)胞內(nèi)膽固醇的負(fù)反饋調(diào)節(jié),能無(wú)限制攝取ox-LDL,高表達(dá)SR-A,促使使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞[10]。膽固醇在ACAT1的作用下生成膽固醇酯，由于膽固醇酯是高度非極性分子，主要以脂滴的形式儲(chǔ)存于胞質(zhì)中，其表達(dá)過(guò)高使膽固醇酯合成增多，泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積[11]。本研究發(fā)現(xiàn)vaspin+ox-LDL跟ox-LDL組SR-A和ACAT1在基因和蛋白表達(dá)都顯著減少(P<0.05)，提示vaspin通過(guò)減少膽固醇積聚來(lái)抑制巨噬細(xì)胞泡沫化。

綜上所述，vaspin通過(guò)調(diào)節(jié)SR-A、ACAT1和ABCA1的表達(dá)水平降低巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平，抑制巨噬細(xì)胞泡沫化。同時(shí)，對(duì)于vaspin對(duì)AS的影響有待于進(jìn)一步的研究和證實(shí)。

[1] 呂煜焱，徐亞偉.新型脂肪因子Vaspin研究進(jìn)展[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版,2013，(5): 116-120.

[2] Motal MC, Klaus DA, Lebherz-Eichinger D, et al. Increased plasma vaspin concentration in patients with sepsis: an exploratory examination[J]. Biochem Med: Zagreb, 2015,25(1): 90-96.

[3] Spiroglou SG, Kostopoulos CG, Varakis JN, et al. Adipokines in periaortic and epicardial adipose tissue: differential expression and relation to atherosclerosis[J]. J Atheroscler Thromb， 2010,17(2): 115-130.

[4] Ji KT, Qian L, Nan JL, et al. Ox-LDL induces dysfunction of endothelial progenitor cells via activation of NF-kappaB[J]. Biomed Res Int, 2015,2015,175291.

[5] 劉興華，彭文輝，李海玲，等.高糖誘導(dǎo)人THP1細(xì)胞Toll樣受體4信號(hào)通路變化及匹伐他汀的拮抗作用[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版,2011，(4): 23-27.

[6] Kadoglou NP, Gkontopoulos A, Kapelouzou A, et al. Serum levels of vaspin and visfatin in patients with coronary artery disease-Kozani study[J]. Clin Chim Acta, 2011,412(1-2): 48-52.

[7] Guan S, Wang B, Li W, et al. Effects of berberine on expression of LOX-1 and SR-BI in human macrophage-derived foam cells induced by ox-LDL[J]. Am J Chin Med, 2010,38(6): 1161-1169.

[8] Zhao Y, Pennings M, Hildebrand RB, et al. Enhanced foam cell formation, atherosclerotic lesion develop-ment, and inflammation by combined deletion of ABCA1 and SR-BI in Bone marrow-derived cells in LDL receptor knockout mice on western-type diet[J]. Circ Res, 2010,107(12): e20-e31.

[9] Zhao TT, Peng R, Shen L, et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitor t-AUCB ameliorates ox-LDL induced conversion of macrophages into foam cells through activating the PPARgamma-ABCA1 pathway[J]. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi, 2012,40(3): 248-252.

[10] Shang W, Yu X, Wang H, et al. Fibroblast growth factor 21 enhances cholesterol efflux in THP-1 macrophage-derived foam cells[J]. Mol Med Rep. 2015,11(1): 503-508.

[11] Liang Y, Yang X, Ma L, et al. Homocysteine-mediated cholesterol efflux via ABCA1 and ACAT1 DNA methylation in THP-1 monocyte-derived foam cells[J]. Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai), 2013,45(3): 220-228.

Inhibitory effects of vaspin on bubbling of macrophages THP-1invitro

ZHUGuo-fu,LINYing,LIWei-ming

(Dept. of Cardiology, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China)

Objective To investigate the effect of vaspin on bubbling of macrophages THP-1 in vitro. Methods Human THP-1 macrophages were induced by phorbol-12-myristate 13-acetate(PMA,100nmol/L) for 48h，then cells were divided into three groups: control group, ox-LDL group(at a final concentration of 50μg/ml for 48h), ox-LDL+vaspin group(vaspin at a final concentration of 100ng/ml, pretreated for 24h). The effect of vaspin on bubbling of THP-1 cells was analyzed by Oil Red 0 staining. The expressions of mRNAs and proteins of ACAT-1，ABCA1 and SR-A1 were detected by real-time PCR and Western blotting, respectively. Results As compared with ox-LDL group, the bubbling level in ox-LDL+vaspin group was decreased significantly. The mRNA and protein expression levels of ACAT-1 and SR-A1 in ox-LDL+vaspin group significantly decreased, while those of ABCA1 mRNA and protein increased significantly(P<0.05). Conclusion Vaspin inhibits the transformation of macrophages to foam cells, thus playing an anti-atherosclerosis role.

vaspin; macrophages; foam cells; acy1-coenzyme; ATP binding cassette transporter A1; acyl-coenzyme A: cholesterolacyltrasferase-1(ACAT-1); scavenger receptor-A1(SR-A1)

10.16118/j.1008-0392.2015.03.007

2015-03-17

祝國(guó)富(1980—)，男，碩士研究生.E-mail: zhuguofu_19880630@163.com

李偉民.E-mail: 18917683469@189.cn

R 541.4

A

1008-0392(2015)03-0031-04