仇鈺瑩，方芳，堵國成，陳堅,4

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葡萄糖二酸研究進展

仇鈺瑩1,2，方芳1,2，堵國成2,3,4，陳堅1,2,4

1 江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122 2 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無錫 214122 3 江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122 4 江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫 214122

仇鈺瑩, 方芳, 堵國成, 等. 葡萄糖二酸研究進展. 生物工程學報, 2015, 31(4): 481–490.Qiu YY, Fang F, Du GC, et al. Progress in glucaric acid. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 481–490.

葡萄糖二酸是一種葡萄糖衍生物，可作為原料制備多種聚合物和生物質新能源，在化工領域具有廣泛的應用價值，被認為是“最具價值的生物煉制產品”之一。葡萄糖二酸也具有調控體內激素、提高機體免疫功能、減少癌癥病發(fā)的作用，它在食品和醫(yī)藥領域的關注度和市場需求逐年增加。目前葡萄糖二酸的制備主要依靠化學氧化法生產，用微生物法合成的研究還處于初級探索階段。本文綜述了葡萄糖二酸的在醫(yī)藥、化工等領域的應用前景，闡述了其生產方法及測定手段，并對微生物法生產葡萄糖二酸進行了展望。

葡萄糖二酸，生物合成，測定，大腸桿菌，糖醛酸

葡萄糖二酸 (Glucaric acid，簡稱GA) 是一種無毒的葡萄糖衍生物，天然存在于葡萄柚、蘋果、橘子等水果和十字花科蔬菜中，在少量哺乳動物及人體內也有分泌[1]。早在1964年，就有學者提出補充糖醛酸類物質，可能有利于提高人體的自然防御機制，有助于消除致癌物質，減少癌癥病發(fā)的風險[2]。隨著研究的深入，葡萄糖二酸及其衍生物——葡萄糖二酸1,4-內酯(DSL) 因其在降低膽固醇、調控人體內激素水平等方面發(fā)揮的作用逐漸受到醫(yī)學界的重視。補充葡萄糖二酸及其衍生物將有可能成為預防和輔助治療癌癥的新對策。葡萄糖二酸在化工領域也有廣泛的應用價值。如可作為聚合物合成的基本單元合成聚酰胺類、羥基化的尼龍 (PHPAs) 及聚二甲基硅氧烷 (BDMS) 聚酰胺[3-5]，合成生物可降解聚合物、緩釋肥料、各種薄膜等[6-7]，也可作為原料生產無毒、可生物降解的磷酸鹽替代物[8]，用于家用洗滌劑、防腐劑和混凝土外加劑等。葡萄糖二酸還可在電鍍中作為金屬防腐的螯合劑[9]。2004年，葡萄糖二酸被美國能源部 (DOE) 確定為12種“最具有價值的生物煉制產品” (Top value added chemicals from biomass) 之一，它作為合成多種高效環(huán)保的新興生物質能源的原料，具有巨大的潛在經濟價值[10]。

1 葡萄糖二酸簡介

葡萄糖二酸是含有4個手性碳原子的化合物，通常以手性化合物D-葡萄糖二酸的形式存在，在水溶液中會自發(fā)氧化，形成單內酯D-葡萄糖二酸-1,4內酯和D-葡萄糖二酸-3,6內酯以及少量的雙內酯D-葡萄糖二酸-1,4;3,6-內酯。在水溶液中，葡萄糖二酸以上述4種化合物形式共同存在[11]。20世紀六七十年代，就有研究者從櫻桃、柑橘等水果和豆類等蔬菜及落葉松等裸子植物的針葉中檢測到葡萄糖二酸的存在[12-13]，在葡萄和柑橘類水果中含量相對較高(3–4 g/kg)，但在果蔬中的總體含量很低(約1 g/kg)[14]。

1.1 葡萄糖二酸的應用

近20年來，人們對葡萄糖二酸在人體內的代謝功能做了較為細致的研究。在哺乳動物體內，葡萄糖二酸和葡萄糖二酸-1,4-內酯是糖醛酸途徑的終產物，它們能夠有效抑制β-葡萄糖醛酸酶 (β-glucuronidase，簡稱βG) 的活性。腸道中的β-葡萄糖醛酸酶可催化葡萄糖醛酸與內外源毒素、膽紅素等物質結合，將致癌物前體轉化為致癌物，并在膽結石形成過程中起重要作用[15]。D-葡萄糖二酸及其衍生物可通過參與人體代謝活動調節(jié)體內激素環(huán)境 (降低類固醇和部分非類固醇如泌乳刺激素含量) 發(fā)揮化學防癌作用，預防和有效抑制如食道癌、結腸癌、激素依賴性癌癥乳腺癌、肝癌、皮膚癌和膀胱癌等病癥[16-21]，并具有降低膽固醇、治療糖尿病等作用[1,22]。最近有研究表明葡萄糖二酸可以降低β-葡萄糖醛酸酶活性，輔助降低雌激素 (葡萄糖醛酸化雌二酮Glucuronidated estradiol) 負擔[23-24]，從而降低患乳腺癌的風險。雖然動物實驗結果支持這一可能性，但目前還沒有評估D-葡萄糖二酸營養(yǎng)補充劑是否對乳腺癌有治療或預防效果的臨床試驗結果。另外，與葡萄糖二酸可相互轉化的葡萄糖二酸-1,4-內酯有很強的解毒和抗氧化性能[25-27]，它可以抑制胰島β細胞凋亡減輕四氧嘧啶 (ALX) 誘導的糖尿病[28]，緩解鹽酸伊立替康 (CPT-11) 引起的腸道黏膜損傷[29]。研究表明，每千克體重攝入4.5 mmol葡萄糖二酸鈣對β-葡糖苷酸酶能發(fā)揮較明顯的抑制作用。由于果蔬中葡萄糖二酸含量微少，通過飲食攝入的葡萄糖二酸含量遠低于可對β-葡糖苷酸酶起抑制作用的水平，因此機體需要額外攝入D-葡萄糖二酸及相關的衍生物來達到預防和治療疾病的效果[14]。

1.2 葡萄糖二酸的市場需求

葡萄糖二酸有較廣泛的應用，隨著醫(yī)藥領域的深入研究，添加D-葡萄糖二酸鈣的強化奶粉和乳制品已用于商業(yè)化生產，醫(yī)藥制劑也正在開發(fā)階段[30]。1998年，世界范圍內的葡萄糖二酸消耗量已達到4.1萬t[31]。美國Rivertop Renewables公司經過多年研究率先于2012年將從葡萄糖轉化葡萄糖二酸的生產由實驗室規(guī)模擴大到工業(yè)生產規(guī)模，達到了單批次生產385.5 kg的規(guī)模。近期，英國Johnson Matthey Davy技術公司與美國Rennovia公司也在聯(lián)合開發(fā)生產葡萄糖二酸和己二酸[32]。

2 葡萄糖二酸的測定

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法 (HPLC法) 是目前檢測葡萄糖二酸較常見的方法，具有樣品處理簡便、定量精確的特點。測定采用有機酸的檢測方法，使用極性反相色譜柱分離樣品，用酸性流動相以防止有機酸解離 (表1)。通常情況下葡萄糖二酸在色譜柱上有較好的保留，并呈現出對稱的峰形。但本課題組在研究中發(fā)現，葡萄糖酸和葡萄糖二酸在HPLC法分離條件下的出峰時間相近，在色譜圖上呈現出一個峰。因此，用HPLC法不能將二者完全分離，進而無法進行準確定量和分析。如果被檢測樣品中同時含有葡萄糖二酸和葡萄糖酸，通常需要對樣品進行預處理。如利用H+型樹脂先吸附雜質鹽類[33]，再利用硼酸凝膠 (Bio-Rad公司) 去除雜酸和其他雜質。硼酸凝膠中的硼酸酯基團因具有可親和吸附共平面順式二羥基的特性[34]，能夠有效區(qū)分是否存在順式二羥基的物質，因而它可與葡萄糖二酸特異性緊密結合。用磷酸鹽緩沖液可洗去未結合的雜酸 (葡萄糖酸、抗壞血酸等)，最后用鹽酸洗脫獲得葡萄糖二酸，達到去除干擾測定雜質的目的。

表1 HPLC法定量分析葡萄糖二酸

*N.A.: not available

2.2 離子色譜法

離子色譜檢測法是一種新型的檢測葡萄糖二酸的手段。其分離原理是被檢測物質經過攜帶相反電荷的色譜柱分離，再由電化學檢測器或電導檢測儀通過電信號的強度進行檢測。該方法具有簡單快速、靈敏度高、結果準確等優(yōu)點，在有機酸的檢測方面有較大優(yōu)勢[38]。用離子色譜法分析葡萄糖硝酸氧化的副產物，一些用HPLC法難以分離的葡萄糖酸、葡萄糖二酸與葡萄糖醛酸等葡萄糖酸衍生物分離度大大提高。

本研究室在前期的研究中，對HPLC法與離子色譜法的檢測效果進行了比較。運用離子色譜檢測葡萄糖二酸，以NaOH作為淋洗液梯度洗脫，可將葡萄糖酸和葡萄糖二酸完全分離并精確定量。

此外，也可運用反相離子對液相色譜測定法測定糖類物質[39]。通過加入離子對試劑四丁基硫酸氫銨與被測離子形成中性的離子對化合物，被檢測物質在非極性固定相中溶解度增大，分離效果得到顯著提高。

2.3 其他檢測方法

咔唑比色法和葡萄糖酸脫氫酶反應法是早期使用的測定尿液中葡萄糖二酸的方法[40-41]。但由于吸光度的檢測易受到抗壞血酸等內源性物質的干擾，酶反應過程易受到酶純度的影響，無法精準對葡萄糖二酸進行定量分析[42]。

液相和質譜聯(lián)用能夠鑒定含葡萄糖二酸的物質組分，為檢測微生物代謝產葡萄糖二酸產物提供了參考依據[43]。氣相色譜-質譜 (GC-MS) 可以精確定量D-葡萄糖二酸的衍生物以及葡萄糖醛酸途徑的其他代謝產物，但樣品衍生化處理步驟復雜且未被臨床和毒理學實驗室廣泛使用[44-45]。

高效毛細管電泳測定(HPCE) 檢測有機酸和葡萄糖二酸-1,4-內酯的方法也已成功建立[46-47]，但同樣因設備局限性未能廣泛使用。

3 葡萄糖二酸的合成方法

3.1 化學氧化法

化學氧化法是目前化工領域制備葡萄糖二酸較為通用的方法。通過氧化D-葡萄糖生產D-葡萄糖二酸。D-葡萄糖氧化過程伴隨著D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸以及醛糖酸等多種物質的生成 (圖1)，控制氧化反應的作用位點和反應條件是獲得較純葡萄糖二酸的關鍵因素。對葡萄糖二酸的原料和氧化劑的篩選試驗發(fā)現用蒽醌類和金屬做催化劑生成產物的選擇性差，成本高；用硝酸、二氧化氮、過氧化氫等強氧化劑合成葡萄糖二酸則有產率低，副產物多，需要后續(xù)處理等問題。因此，投入高、得率低 (絕大部分小于55%) 是目前化學氧化法生產葡萄糖二酸的主要問題。結合經濟效益和產物得率，當前D-葡萄糖二酸的化學氧化法主要以硝酸氧化法和TEMPO氧化法為主。

3.1.1 硝酸氧化法

D-葡萄糖二酸的合成制備可追溯到19世紀，采用硝酸氧化葡萄糖的方法[48]，將葡萄糖氧化成為葡萄糖二酸及小分子量有機酸，通過控制反應程度得到相應產物。后來研究者在該方法的基礎上做出了一些改進。如選用淀粉為原料，用硫酸水解，再加入濃硫酸、硝酸及催化劑MoO3，加熱至有氮氧化物氣體放出，再緩慢加入硝酸，減少了反應的劇烈程度但葡萄糖二酸的收率僅為40%[49]?；蛴醚踝鳛榻K端氧化劑，用加氧加壓的方式在計算機控制的密閉反應器中控制反應溫度提高了硝酸的利用率并將產率提高到85%[50]。還有學者運用各種類型的生物質作為原料，將氧化反應過程的時間降低到30 min[51]。硝酸氧化法最大的優(yōu)勢在于，硝酸可以既作為溶劑又作為試劑進行反應。不足之處在于，氧化葡萄糖末端羥基和伯醇羥基可以很容易得到葡萄糖二酸，然而氧化α-羥基碳可能會形成5-酮基-葡萄糖酸，氧化造成的C-C鍵斷裂會使產物分解最終形成草酸或碳酸。20世紀中期，硝酸氧化法已擴大到工廠試驗的規(guī)模[52-53]。但由于該方法投入高產出低 (得率<50%)，有劇烈放熱和較多的副反應，并有大量NO和NO2等有害氣體排放，對環(huán)境造成污染，未能運用于大規(guī)模工業(yè)化生產。

圖1 D-葡萄糖氧化產葡萄糖二酸及有機酸副產物[35]

3.1.2 TEMPO電化學氧化法

TEMPO氧化法是指利用2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧自由基 (TEMPO) 介導的電化學氧化葡萄糖合成葡萄糖二酸的方法。TEMPO是20世紀60年代發(fā)現的一種亞硝酰自由基，它的氮氧自由基能夠在氮氧之間移動形成共振結構。由于它催化的氧化反應無金屬參與且反應條件溫和，對產物具有選擇性并能夠限制不可回收的副產物的產生，使之成為碳水化合物合成的理想介導物質[54]。有研究者考察了不同pH、溫度和助氧化劑條件下該方法對D-葡萄糖氧化產物的影響，證實了在理想的反應條件下，葡萄糖二酸的得率可以超過85%[55]。

3.2 微生物法生產葡萄糖二酸

微生物發(fā)酵法是長期以來實現有機酸高效環(huán)保生產的常用方法。同化學法相比，微生物發(fā)酵法在原料損耗、產品純度等方面有較大改善，成為一種更優(yōu)的合成方法。在哺乳動物體內，由葡萄糖正常代謝獲得葡萄糖二酸需要經過十步以上反應[1]。目前用微生物發(fā)酵法生產葡萄糖二酸的研究尚處于初級階段，并沒有關于微生物存在完整的從葡萄糖到葡萄糖二酸天然合成途徑的報道。而人工構建葡萄糖二酸生物合成途徑，則主要是通過克隆和表達醛酸脫氫酶[56-57]實現將葡萄糖醛酸脫氫轉化為葡萄糖二酸，或者是在大腸桿菌內構建從葡萄糖到葡萄糖二酸的全合成途徑[36]。此外，研究者對糖醛酸途徑中與合成葡萄糖二酸的前體葡萄糖醛酸，和酸性條件下能與葡萄糖二酸相互轉化的葡萄糖二酸-1,4-內酯也進行了結構和特性上的分析[58-59]?，F階段，葡萄糖二酸的微生物生產方法主要以合成生物學和紅茶菌發(fā)酵為代表。麻省理工學院Moon等用合成生物學技術手段對大腸桿菌進行了改造，人工構建了葡萄糖二酸的全合成途徑成功地實現葡萄糖二酸的生物合成。采用天然混合菌發(fā)酵的方法，可以合成少量的葡萄糖二酸和葡萄糖二酸-1,4-內酯 (表2)。

3.2.1 大腸桿菌工程菌合成葡萄糖二酸

首例微生物合成葡萄糖二酸的菌株是利用合成生物學的方法構建的工程菌[36]。研究者通過引入3個外源基因——釀酒酵cc母中的肌醇-1-磷酸合成酶基因 ()，小鼠體內的肌醇氧化酶基因 (MIOX)及丁香假單胞菌中的醛酸脫氫酶基因 () 進行異源表達，在中構建了葡萄糖二酸的生物代謝合成途徑 (圖2)。該途徑中，可使細胞代謝積累肌醇，MIOX催化肌醇轉化為葡萄糖醛酸，是關鍵步驟的限速酶，UDH催化葡萄糖醛酸轉化生成葡萄糖二酸。該方法使葡萄糖二酸的產量由毫克級提高到了克級(1.13 g/L)。隨后，Eric等對MIOX基因進行了強化，將以肌醇為底物的葡萄糖二酸的產量提高到4.85 g/L[60]。此外，研究中還發(fā)現葡萄糖二酸在以肌醇為底物生產時存在產物限制，葡萄糖二酸的產量無法突破5 g/L，這是提高葡萄糖二酸產量需要繼續(xù)攻克的問題。在此基礎上，Kazunobu等嘗試使用多種來源的、MIOX和UDH構建大腸桿菌葡萄糖二酸全合成途徑，添加并強化了肌醇單磷酸酯酶，采用補料發(fā)酵策略并控制培養(yǎng)基中葡萄糖水平，使以葡萄糖為底物生產葡萄糖二酸的產量達到了73 g/L[61]。

3.2.2 紅茶菌發(fā)酵產葡萄糖二酸

紅茶菌是以含有葡萄糖的茶水為原料，經過醋酸菌、酵母菌和乳酸菌等多種微生物的復合體 (菌膠膜) 共同發(fā)酵而成的一種酸性飲料。一些學者對紅茶菌發(fā)酵液中的成分進行了分析，發(fā)現其培養(yǎng)液中含有較高含量的葡萄糖二酸-1,4-內酯 (8.6 mg/mL)，而在糖醛酸途徑中葡萄糖二酸是葡萄糖二酸-1,4-內酯的前體，因而推測紅茶菌發(fā)酵液中含有較高含量的葡萄糖二酸[58]。由于微生物是否存在糖醛酸途徑尚未得到證實，該推斷還需進一步驗證才可以確認。也有研究者用HPLC/MS/PAD (高效液相色譜/質譜/光電掃描) 的方法對來自美國和世界其他地區(qū)的19種紅茶菌樣品進行了化學成分分析，未檢測出葡萄糖二酸和葡萄糖醛酸[62]。由于培養(yǎng)條件、分析方法、菌種來源等差異得到的結果也存在差異，因此紅茶菌是否可以以葡萄糖為原料發(fā)酵生產葡萄糖二酸還需更多研究加以證實。

表2 微生物發(fā)酵法生產葡萄糖二酸

圖2 基因改造大腸桿菌合成葡萄糖二酸途徑[36]

4 葡萄糖二酸研究展望

葡萄糖二酸作為化工、醫(yī)藥及食品等領域產品中的重要中間體，在降低成本、合成可再生能源和可持續(xù)發(fā)展等方面有巨大的應用前景和重要的經濟潛力?，F階段葡萄糖二酸生產的化學方法日趨成熟，但是國內外都未能形成規(guī)?；a。微生物法生產葡萄糖二酸仍處于研究階段，還需要對葡萄糖二酸在微生物體內的代謝，對生產菌株的改良等方面進行進一步研究，對如何在發(fā)酵過程中提高合成產物的能力、提高發(fā)酵生產強度、縮短發(fā)酵時間等問題進行發(fā)酵優(yōu)化。注重葡萄糖二酸的抗癌機制和可再生利用的特點對其進行具體而深入的研究將使其應用方面體現出更大的社會價值。

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(本文責編陳宏宇)

Progress in glucaric acid

Yuying Qiu1,2, Fang Fang1,2, Guocheng Du2,3,4, and Jian Chen1,2,4

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 3 Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 4 National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Glucaric acid (GA) is derived from glucose and commonly used in chemical industry. It is also considered as one of the “Top value-added chemicals from biomass” as carbohydrate monomers to produce various synthetic polymers and bioenergy. The demand for GA in food manufacture is increasing. GA has also attracted public attentions due to its therapeutic uses such as regulating hormones, increasing the immune function and reducing the risks of cancers. Currently GA is produced by chemical oxidation. Research on production of GA via microbial synthesis is still at preliminary stage. We reviewed the advances of glucaric acid applications, preparation and quantification methods. The prospects on production of GA by microbial fermentation were also discussed.

glucaric acid, biosynthesis, quantification,, glucarate

July 1, 2014; Accepted: September 2, 2014

Fang Fang. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918039; E-mail: ffang@jiangnan.edu.cn

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