劉蘭香，鄭華，錢岐雄，張雯雯，高山，張弘

（中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，國家林業(yè)局特色森林資源工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650224）

胭脂蟲紅色素（cochineal）作為昆蟲來源的天然染色劑有著悠久的歷史[1-2]，不僅具有優(yōu)質(zhì)的染色能力，并且具有安全性較高、健康、營養(yǎng)和生理活性效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊[3-4]。胭脂蟲紅色素的主要染色成分為胭脂紅酸，每個胭脂紅酸分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)包含一個核心蒽醌環(huán)和一個多羥基的六元環(huán)結(jié)構(gòu)單元[5-6]，具有極好的水溶性，卻幾乎不溶于油脂類物質(zhì)[7]。通過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾的方法在胭脂紅酸分子中引入疏水性的烷基和脂溶性的醚鍵、酯基等來改善色素的油溶性可拓展其在各個領(lǐng)域的運(yùn)用。胭脂紅酸分子中的羥基可以與羧酸、酰氯、酸酐等發(fā)生酯化反應(yīng)而減少分子中親水性羥基的數(shù)目，同時增加親油性的酯基使分子極性減小從而有利于改善胭脂蟲紅色素的油溶性。乙酸酐是一種是重要的乙?；噭?，其遇水水解后即生成無毒害且易除去的乙酸，且乙酸酐相對于羧酸、酰氯和其他酸酐具有反應(yīng)高效、反應(yīng)體系綠色、無污染等優(yōu)點(diǎn)，本工作以乙酸酐/乙酸為反應(yīng)體系對胭脂蟲紅酸分子進(jìn)行化學(xué)修飾，期望改善胭脂蟲紅色素的油溶性，同時保持色素原有的優(yōu)良著色性能。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

胭脂蟲紅色素，中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所從自主培養(yǎng)的胭脂蟲中分離提?。挥衩子?，嘉里糧油有限公司；乙酸酐、乙酸、乙酸乙酯、無水乙醇、無水硫酸鈉、甲醇、乙醇、乙醚、石油醚、甲苯，均為分析純，西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB204-型精密型電子天平，梅特勒-托利多（中國）有限公司； AC-MAGHS-7 型磁力攪拌器，廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司； TY742X2A 型純水機(jī)，美國Barnstead 公司；N1000 Rotavapor Rll 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會社；101A-2 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司； TENSON27 型傅里葉變換紅外光譜儀，德國布魯克光譜儀器有限公司； DU800 型紫外-可見光分光光度計，美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 油溶性胭脂蟲紅色素衍生物制備的一般合成方法

稱取0.50g 胭脂蟲紅色素于50mL 圓底燒瓶中，然后按一定比例加入總體積為20mL 的乙酸酐和乙酸，再加入一定量的三乙胺。隨后將裝有反應(yīng)混合液的圓底燒瓶置于裝有冷凝回流裝置的控溫磁力攪拌上，調(diào)控反應(yīng)體系的溫度進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)過程中，使用薄層色譜法（TLC）監(jiān)測[8]，間隔30min，當(dāng)TLC 顯示原料點(diǎn)完全消失時停止反應(yīng)，總反應(yīng)時間約為8h。

反應(yīng)停止后，待反應(yīng)混合溶液自然冷卻至室溫，加入去離子水45mL 攪拌45min，使乙酸酐充分水解生成乙酸。停止攪拌后將混合液減壓蒸餾，然后置于溫度為60℃的干燥箱中干燥10h，即可得到目標(biāo)產(chǎn)物，產(chǎn)物為紅色的固體。

1.3.2 制備油溶性胭脂蟲紅色素衍生物實(shí)驗(yàn)條件的單因素考察與優(yōu)化驗(yàn)證

稱取0.50 g 胭脂蟲紅色素，加入總體積為20mL的乙酸酐與乙酸，保持每次乙酸酐的用量變化為2mL，乙酸酐用量分別為6mL，8mL，10mL，12mL，14mL；催化劑三乙胺(Et3N)的用量分別為0，0.5mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL；反應(yīng)溫度分別為50℃，60℃，70℃，80℃，90℃；反應(yīng)時間分別為4h，6h，8h，10h，12h 的條件下，每次保持其中三個量不變，改變另外一個量，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，每組平行3 次，經(jīng)恒溫非水相反應(yīng)后分離提純得到改性后的油溶性胭脂蟲紅色素衍生物。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.5 軟件，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計，分別以乙酸酐用量、溫度、催化劑用量3 個因素為響應(yīng)變量，以油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的收率[9]作為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化。

對最佳參數(shù)進(jìn)行圓整，在此條件下進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，與響應(yīng)面優(yōu)化預(yù)測值進(jìn)行比較。

1.3.3 油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的表征與鑒定

使用UV-VIS 分光光度計測定色素樣品的在可見光區(qū)的最大吸收波長及其吸光度值，鑒別胭脂蟲紅色素改性前后的差異。

采用KBr 壓片法進(jìn)行FT-IR，根據(jù)所得IR 譜圖，對改性后色素衍生物進(jìn)行結(jié)構(gòu)的初步表征。

1.3.4 色素的色價測定

色價也稱比吸光度，是反映一種色素顏色深淺的指標(biāo)，按照比色法[10-11]測定改性前后色素的色價。

1.3.5 胭脂蟲紅色素改性前后的油溶性鑒定

將準(zhǔn)確稱量的紅色素樣品溶解于食用玉米油中，同時設(shè)定不加入色素的油樣為空白對照樣品，使用紫外可見分光光度計，選擇最大吸收波長，測定溶液的吸光度值，記錄檢測時間。計算油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的保存率，從而評價油溶性胭脂蟲紅色素衍生物在食用玉米油中的溶解穩(wěn)定性[12-13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 油溶性胭脂蟲紅色素衍生物制備方法的討論

酸酐與羥基酯化的反應(yīng)中，常選用酸性或堿性催化劑來促進(jìn)反應(yīng)的發(fā)生[14]。在前期試驗(yàn)中，乙酸酐/乙酸的反應(yīng)體系中分別選用了濃硫酸和三乙胺作為催化劑。試驗(yàn)結(jié)果顯示，濃硫酸和三乙胺都可催化促使反應(yīng)的進(jìn)行，但是使用濃硫酸時產(chǎn)物收率較低，且加入濃硫酸易使原料碳化；當(dāng)催化劑選用三乙胺時，不但可以提高產(chǎn)物收率，而且在后處理時減壓蒸餾即可除去。因此，選擇三乙胺做催化劑。

制備油溶性胭脂蟲紅色素時，反應(yīng)后處理的操作尤為關(guān)鍵，當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后需加入適量的水使未反應(yīng)的酸酐徹底水解，若加入水的量過少或水解時間減短，則會造成產(chǎn)品含有部分酸酐，影響產(chǎn)品顏色，造成產(chǎn)品質(zhì)量不佳。制備油溶性胭脂蟲紅色素的最后一步操作為減壓蒸餾，經(jīng)減壓蒸餾可回收再利用乙酸，同時得到的固體即為目標(biāo)產(chǎn)物。因此，本實(shí)驗(yàn)因溶液體系綠色、無污染，后處理簡單易操作有運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)的可能。

2.2 制備油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 溫度對油溶性胭脂蟲紅色素衍生物收率的 影響

溫度對油溶性胭脂蟲紅色素衍生物收率的影響如圖1 所示。

從圖1 可以看出，在乙酸酐與乙酸用量均為10 mL，催化劑用量為1.0mL，反應(yīng)時間為8h 的條件下，在一定范圍內(nèi)，產(chǎn)物收率隨著反應(yīng)溫度的升高而增加，當(dāng)反應(yīng)溫度為70℃時可獲得最高收率，其值為65.3%；繼續(xù)升高溫度，產(chǎn)物收率反而降低，當(dāng)溫度為90℃時，收率僅為47.7%。本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)產(chǎn)物收率受溫度影響較大，可能是因?yàn)橐宜狒c胭脂紅酸分子酯化的過程是酸酐分子中酰基碳原子上的親核取代反應(yīng)，反應(yīng)需要一定的能量，低溫時，反應(yīng)物的活性較低不利于反應(yīng)的進(jìn)行[15-16]；但是，當(dāng)溫度較高時，胭脂蟲紅色素原料中的其他雜質(zhì)發(fā)生變化，從而對生成目標(biāo)產(chǎn)物的主反應(yīng)產(chǎn)生干擾而降低了收率。因此，本反應(yīng)需要在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件 下進(jìn)行，選擇溫度70℃為中心點(diǎn)，60～80℃為響應(yīng)面優(yōu)化區(qū)間。

圖1 反應(yīng)溫度對油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的收率的影響

2.2.2 乙酸酐對油溶性胭脂蟲紅色素衍生物收率的影響

控制乙酸酐與乙酸用量總體積為20mL，其中乙酸酐的用量對油溶性胭脂蟲紅色素衍生物收率的影響如圖2 所示。

圖2 乙酸酐用量對油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的收率的 影響

從圖2 可以看出，在溫度為70℃，催化劑用量為1.0mL，反應(yīng)時間為8h 的條件下，乙酸酐的用量直接影響油溶性胭脂蟲紅色素衍生物收率。目標(biāo)產(chǎn)物的收率隨著乙酸酐用量的增加而逐漸增大，當(dāng)乙酸酐用量為10mL 時可獲得最高為65.1%的收率；當(dāng)乙酸酐的用量繼續(xù)增加，收率稍有降低。這可能與該反應(yīng)的機(jī)理有關(guān)：胭脂紅酸分子中的—OH 具有親核性，可以進(jìn)攻乙酐的活性羰基碳，然后離去一分子乙酸同時生成目標(biāo)產(chǎn)物乙酸酯[17]。每個胭脂紅酸分子有八個羥基，足量的乙酸酐才能保證分子中的羥基盡可能多的與酸酐生成最終的目標(biāo)產(chǎn)物；但是當(dāng)乙酸酐繼續(xù)過量時，原料胭脂紅酸以消耗完全，反應(yīng)不再進(jìn)行，而且過量的乙酸酐在后期水解時對產(chǎn)物造成了損耗而使收率降低。因此，控制乙酸酐與乙酸總用量為20mL，選擇乙酸酐用量10mL為中心點(diǎn)，以8～12mL 為響應(yīng)面優(yōu)化區(qū)間。

2.2.3 催化劑用量對油溶性胭脂蟲紅色素衍生物收率的影響

催化劑用量對油溶性胭脂蟲紅色素衍生物收率的影響如圖3 所示。從圖3 可以看出，在乙酸酐與乙酸用量均為10mL，溫度為70℃，反應(yīng)時間為8h 的條件下，必須有催化劑反應(yīng)才能進(jìn)行[17]；而且一定范圍內(nèi)，油溶性胭脂蟲紅色素的收率隨著催化劑Et3N 用量的增加而增加，當(dāng)Et3N 用量為1.0mL 時可獲得65.2%的收率，繼續(xù)增加Et3N 用量，收率基本沒有變化。這是因?yàn)镋t3N 是較強(qiáng)的親核試劑，容易與乙酸酐分子中的羰基發(fā)生親核反應(yīng)從而催化酸酐與胭脂紅酸分子的反應(yīng)；另一方面，乙酸酐與胭脂紅酸分子發(fā)生酯化的同時產(chǎn)生乙酸，反應(yīng)中加入堿性三乙胺可中和產(chǎn)生的酸從而有利于反應(yīng)向生成酯的方向進(jìn)行。因此，選擇催化劑用量1.0mL 為中心點(diǎn)，以0.5～1.5mL 為響應(yīng)面優(yōu)化區(qū)間。

圖3 催化劑用量對油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的收率的 影響

2.2.4 反應(yīng)時間對油溶性胭脂蟲紅色素衍生物收率的影響

從圖4 可以看出，在乙酸酐與乙酸用量均為10 mL，溫度為70℃，催化劑用量為1.0mL 的條件下，油溶性胭脂蟲紅色素衍生物在反應(yīng)時間6h 時即有目標(biāo)產(chǎn)物生成；隨后反應(yīng)時間增加，收率也隨著增大，但是8h 后收率基本不發(fā)生變化，反應(yīng)時間為8h 的獲得產(chǎn)物的收率是65.2%。因此，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時，所有反應(yīng)的時長保持為8h。

2.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化法制備油溶性胭脂蟲紅色素

2.3.1 胭脂蟲紅色素收率模型的建立

圖4 反應(yīng)時間對油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的收率的影響

通過單因素試驗(yàn)得到乙酸酐與乙酸的用量比、 反應(yīng)溫度、催化劑用量的優(yōu)化區(qū)間表，如表1 所示。

利用 Design-Expert 8.0.5 軟件，采用 Box- Behnken 試驗(yàn)設(shè)計，選擇質(zhì)量比、溫度、催化劑用量3 個因素為變量，得到如表2 所示的試驗(yàn)結(jié)果。

對所得實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，獲得油溶性胭脂蟲紅色素收率Y 的多元二次多項(xiàng)回歸方程為：

在回歸方程中，X 變量的正系數(shù)表明，該變量的正向變化能引起響應(yīng)值的增加，負(fù)的二次項(xiàng)系數(shù)表明方程的拋物面開口向下，具有極大值點(diǎn)，能夠進(jìn)行最優(yōu)分析[18]。

如表3 的數(shù)據(jù)所示，模型的P=0.0001，失擬項(xiàng)的值P=0.0002，二者的差異性不顯著，且回歸模型的擬合系數(shù)為0.9918，說明該模型與實(shí)驗(yàn)之間的擬合度較好，具有較高的可靠性[19]，客觀地反映了油溶性胭脂蟲紅色素衍生物收率與溫度、乙酸酐用量、催化劑用量的關(guān)系，可用于分析和預(yù)測改性后的胭脂蟲紅色素的收率的工藝結(jié)果。一次項(xiàng)T，V，E 及二次項(xiàng)T2，V2，E2的P 值均小于0.05，說明溫度、乙酸酐用量、催化劑用量對產(chǎn)物收率都產(chǎn)生顯著 影響。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表

表2 Box-Behnken 設(shè)計試驗(yàn)結(jié)果

表3 油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的收率回歸方程方差分析

通過以上數(shù)據(jù)得到模型的響應(yīng)曲面及其等高線圖，見圖5。圖5 針對反應(yīng)溫度、乙酸酐用量、催化劑用量三個因素對胭脂蟲紅色素衍生物收率的影響得出了直觀、準(zhǔn)確的評價：催化劑用量的影響大于反應(yīng)溫度，反應(yīng)溫度的影響大于乙酸酐用量。

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過Design-Expert 8.0.5 優(yōu)化，得出乙酸酐酯化法制備油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的最佳條件為：胭脂蟲紅色素0.5g; 乙酸酐與乙酸用量均為10mL; 催化劑三乙胺用量為1.0mL; 反應(yīng)溫度70℃; 反應(yīng)時間為8h。在上述最佳組合條件下，油溶性的胭脂蟲紅色素的收率預(yù)測值為64.5%。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷暮侠硇裕谲浖治龀龅淖罴褩l件下進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，測得油溶性胭脂蟲紅色素衍生物收率平均值為65.2%，偏差為0.0108，說明以上分析與改善的條件與實(shí)際情況擬合較好，說明該響應(yīng)曲面法優(yōu)化得出的最佳工藝條件合理可行。

2.4 油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的紅外光譜表征與鑒定

圖5 兩個因素交互作用影響油溶性胭脂蟲紅色素收率的響應(yīng)曲面圖

圖6 胭脂蟲紅色素和油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的紅外 譜圖

圖6 為胭脂蟲紅色素和改性后得到的油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的FTIR 譜圖。從圖6 中可以看 出，與胭脂蟲紅色素相比較，經(jīng)乙酸酐改性后的胭脂蟲紅色素衍生物在波數(shù)為3000～3500cm-1區(qū)域內(nèi)的—OH 吸收峰明顯變窄，說明原胭脂紅酸分子中羥基的數(shù)目減少；明顯特征是胭脂蟲紅色素衍生物在1715cm-1處出現(xiàn)了非共軛脂肪酸/酯中C=O引起的伸縮振動吸收峰[20-21]，且在1230cm-1左右可以找到由酯基中—C—O—C—引起的伸縮振動吸收峰[20-21]。以上紅外吸收峰的變化表明乙酸酐/乙酸體系有效修飾了胭脂紅酸分子的結(jié)構(gòu)，在胭脂紅酸分子中同時引入了烷基和酯基。

2.5 油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的紫外-可見光 譜圖

圖7 為胭脂蟲紅色素及乙酸酐改性后的油溶性胭脂蟲紅色素衍生物溶解于乙醇溶液中檢測出的紫外-可見光譜圖。

圖7 胭脂蟲紅色素和油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的紫外-可見光光譜圖

如圖7 所示，在可見光區(qū)，胭脂蟲紅色素與乙酸酐改性后的胭脂蟲紅色素衍生物的最大吸收波長分別為496nm 和463nm，改性后得到的油溶性胭脂蟲紅色素的吸收帶發(fā)生藍(lán)移，這可能是由于改性后分子中存在n→π*躍遷的酯鍵，使得吸收帶向短波長方向移動[20，22-23]，但是其最大吸收波長仍與文獻(xiàn)報道的蒽醌類化合物相符[22-23]，表明乙酸酐/乙酸反應(yīng)體系改性得到的胭脂蟲紅色素衍生物的發(fā)色團(tuán)仍然是蒽醌環(huán)。

2.6 胭脂蟲紅色素的色價測定

胭脂蟲紅色素及改性后的油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的在可見光區(qū)最大吸收波長分別為496nm和463nm，通過測定它們在最大吸收波長處的吸光度值，計算出它們色價結(jié)果如表4 所示。

如表4 所示，經(jīng)改性得到的胭脂蟲紅色素衍生物較原料胭脂蟲色素的色價值提高了39，說明改性后得到的產(chǎn)物著色能力增強(qiáng)。

表4 胭脂蟲紅色素及改性后的胭脂蟲紅色素衍生物的色價（20℃）

2.7 油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的溶解性

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)乙酸酐/乙酸體系改性后得到的胭脂蟲紅色素衍生物的溶解性發(fā)生了根本性的變化，其幾乎不溶于水，卻易溶于大部分有機(jī)溶劑中，如乙酸乙酯、乙醇、丙酮等溶劑中；也可微溶于乙醚、石油醚等極性較小的有機(jī)溶劑中；同時，色素產(chǎn)物能溶于玉米油。胭脂蟲紅色素衍生物溶解于玉米油中的結(jié)果見圖8。如圖8 所示，經(jīng)改性得到的產(chǎn)物溶解于食用玉米油中染色效果較強(qiáng)，油樣顏色呈橙紅色，說明改性后的胭脂蟲紅色素衍生物在食用玉米油中溶解性好，且具有較佳的著色能力。油樣放置1 個月后，油樣依然清亮、透明度良好，沒有渾濁或者沉淀產(chǎn)生。

將胭脂蟲紅色素及改性后得到的產(chǎn)物分別添加于去離子水和食用玉米油中，測定它們的溶解度，結(jié)果見表5 所示。如表5 所示，經(jīng)乙酸酐/乙酸反應(yīng)體系改性后得到的胭脂蟲紅色素衍生物在玉米油的溶解度為2.41。這個結(jié)果表明，乙酸/乙酸酐體系有效地修飾了胭脂紅酸分子的結(jié)構(gòu)，減少了分子中親水的羥基基團(tuán)，同時增加了疏水性的酯基基團(tuán)，使得分子極性減小，從而增強(qiáng)了其在油中的溶 解性[24-25]。

圖8 添加油溶性胭脂蟲紅色素衍生物（左）和未添加（右）玉米油的照片

表5 油溶性胭脂蟲紅色素衍生物在玉米油和水中的溶解度（20℃）

經(jīng)乙酸/乙酸酐反應(yīng)體系改性后得到的胭脂蟲紅色素衍生物溶解在食用玉米油中的穩(wěn)定性見 表6。

表6 油溶性胭脂蟲紅色素衍生物溶解在食用玉米油中的 穩(wěn)定性

如表6 所示，將色素產(chǎn)物溶解于食用玉米油中，在室內(nèi)自然光的條件下，定期測定其吸光度值，經(jīng)30 天的追蹤觀察后發(fā)現(xiàn)初始的10 天內(nèi)，色素油溶液的吸光度值不但沒有減小反而增大，說明這段時間內(nèi)色素產(chǎn)品中的某些成分對色素的穩(wěn)定性有一定的影響；之后，色素的保存率逐漸減小，但是30天時，色素的保存率依然達(dá)到69.34%，說明色素在油中的穩(wěn)定性較好，具有開發(fā)和應(yīng)用潛在價值與 前景。

3 結(jié) 論

（1） 乙酸酐/乙酸法有效地修飾了胭脂蟲紅酸分子，通過紫外光譜、紅外光譜對所得到的目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行了初步的結(jié)構(gòu)表征，表明胭脂蟲紅酸分子中增加了酯基和烷基，由于胭脂紅酸分子的極性減小，使得改性后的色素分子極性與油脂分子的極性相差不大，有助于改性后的色素在油樣中的溶解度增加。

（2）乙酸酐/乙酸法制備油溶性胭脂蟲紅色素衍生物的最佳工藝參數(shù)為：胭脂蟲紅色素0.5g; 乙酸酐與乙酸用量均為10mL; 催化劑三乙胺用量為1.0mL; 反應(yīng)溫度70℃; 反應(yīng)時間為8h。進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，測得油溶性胭脂蟲紅色素衍生物收率平均值為65.2%。該工藝條件下理論與實(shí)際的收率偏差僅為0.0108，說明此模型具有一定的合理性，可以作為實(shí)際的預(yù)測。

（3）乙酸酐/乙酸反應(yīng)體系綠色、無毒害，后處理操作簡單，副產(chǎn)物為乙酸可回收利用，符合綠色化學(xué)倡導(dǎo)的理念。制備得到的油溶性胭脂蟲紅色素衍生物在玉米油中的溶解度為2.41，且穩(wěn)定性良好，說明胭脂蟲紅色素的油溶性得到有效的改善，具有開發(fā)和應(yīng)用潛在價值與前景。

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