生物酶制劑對(duì)采后菜心毒死蜱殘留的降解作用

丁杰+張菁+劉婕++何玥++鐘國(guó)華

摘要：建立了菜心毒死蜱殘留氣相色譜檢測(cè)方法，在0.01～2.00 mg/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回收率為77%～89%，變異系數(shù)在2.0%～7.9%之間。供試酶制劑對(duì)采后菜心毒死蜱殘留具有明顯的去除效果，去除率與起始處理的毒死蜱濃度和降解酶制劑的稀釋倍數(shù)有關(guān)。菜心起始浸泡濃度為毒死蜱有效成分400、40、4 mg/L時(shí)，分別以降解酶制劑稀釋1倍（即原液）、10倍、100倍處理，結(jié)果表明，稀釋倍數(shù)為1倍和10倍時(shí)，總體差異不明顯，毒死蜱殘留去除率均保持在84%～96%，但稀釋100倍時(shí)，顯著低于前兩者，去除率分別為59.41%、79.59%和66.77%。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，供試的生物降解酶制劑去除采后菜心毒死蜱的適宜稀釋倍數(shù)為10～100倍，對(duì)4～400 mg/L菜心毒死蜱殘留可有效去除59%～92%。

關(guān)鍵詞：酶制劑；毒死蜱；菜心；降解

中圖分類號(hào)：S481.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）11-2644-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.022

Degradation of Chlorpyrifos Residual by Enzyme Preparation

in Postharvest Chinese Flowering Cabbage

DING Jie1，ZHANG Jing1，LIU Jie1，HE Yue2，ZHONG Guo-hua1

（ 1. Lab of Insect Toxicology， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China； 2. Zhuhai Supervision & Testing Institute of Quality and Metrology， Zhuhai 519075， Guangdong，China）

Abstract：Chinese flowering cabbage of chlorpyrifos residue gas chromatography method was established，which showed good linear relationship with the concentration of 0.01～2.00 mg/L and the recovery was 77%～89%，and coefficient variation was 2.0%～7.9%.The selected enzyme preparation had obvious removal effect to chlorpyrifos residue in postharvest Chinese flowering cabbage and the removal rate was related to the dilution ratio and the initial concentration of chlorpyrifos.The removal of chlorpyrifos was determined by diluting the preparation to 1，10 and 100 times with Chinese flowering cabbage chlorpyrifos active ingredients initial concentrations of 400 mg/L，40 mg/L and 4 mg/L， respectively. Results showed that the removal rate of chlorpyrifos was 84%～96% when dilution ratios were 1 and 10 times. However， removal rate of 100 times diluted preparation was remarkably lower than the former two preparations which were 59.41%，79.59% and 66.77%，respectively.According to the experimental results， the most appropriate dilution ratio of enzyme preparation was 10 to 100 times and 59%～92% of chlorpyrifos residue was eliminated.

Key words： enzyme preparation； chlorpyrifos； Chinese flowering cabbage； degradation

毒死蜱（Chlorpyrifos）是一種高效、廣譜、中等毒性的有機(jī)磷酸酯類殺蟲劑，廣泛應(yīng)用于水稻、果樹、蔬菜等作物害蟲防治，是目前全球應(yīng)用最廣泛的5種殺蟲劑之一。我國(guó)農(nóng)林業(yè)從20世紀(jì)末開始使用毒死蜱，特別是由于劇毒有機(jī)磷農(nóng)藥逐漸被限制生產(chǎn)和使用，客觀上促使毒死蜱用量大增。但大量研究表明，即使是極低劑量毒死蜱殘留仍具有顯著的生物毒性內(nèi)分泌干擾作用，長(zhǎng)期大量累積可能會(huì)對(duì)人類呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、甚至免疫系統(tǒng)產(chǎn)生危害[1]，尤其對(duì)兒童健康有害[2]，國(guó)際上對(duì)毒死蜱的監(jiān)管甚嚴(yán)[3]。因此，必須尋找新技術(shù)解決毒死蜱的生產(chǎn)應(yīng)用與保證農(nóng)產(chǎn)品安全之間的矛盾。篩選高效降解菌，提取降解酶，是國(guó)際上解決農(nóng)藥殘留的發(fā)展方向和研究熱點(diǎn)之一[4，5]。國(guó)內(nèi)外研究表明，生物降解是控制和去除毒死蜱殘留的有效途徑之一。在前期研究中，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)胡美英教授課題組自主篩選獲得了毒死蜱高效降解真菌，提取其粗酶液，深入研究了其分子特征[6]，研究了粗酶液制劑配方的優(yōu)化，研制成可應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品毒死蜱生物降解的制劑[7]。本文定量評(píng)估了制劑對(duì)采后菜心表面毒死蜱殘留的降解效果，旨在為今后商品化生產(chǎn)生物降解酶制劑處理農(nóng)產(chǎn)品毒死蜱等有機(jī)磷農(nóng)藥殘留提供理論基礎(chǔ)。endprint

1 材料與方法

1.1 菌種和降解酶制劑

毒死蜱高效降解菌株Cladosporium cladosporioides （Fresen.） de Vries HP-Z-01，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)胡美英教授課題組從農(nóng)藥廠廢水中分離篩選獲得，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心菌種保存號(hào)CCTCCM20711。降解酶制劑為液體制劑，配制基本配方和基礎(chǔ)參數(shù)見文獻(xiàn)[7]，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行技術(shù)改進(jìn)制備所得，制劑中粗酶蛋白含量按Bradford法測(cè)定為1 000 mg/kg，制劑制備后置于陰涼處貯存3個(gè)月內(nèi)使用。

1.2 藥品試劑與儀器

97%毒死蜱原藥、48%毒死蜱乳油（樂斯本），美國(guó)陶氏益農(nóng)公司惠贈(zèng)，同時(shí)選取具有清洗果蔬表面農(nóng)藥殘留功能的某品牌果蔬清洗劑A作為對(duì)照，其余所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；毒死蜱殘留濃度分析采用HP-6890氣相色譜儀（美國(guó)惠普公司），冷凍高速離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、高速組織搗碎機(jī)、HS-3C精密pH計(jì)、超凈工作臺(tái)、DHZ-D冷凍恒溫振蕩器、電熱恒溫水浴鍋、超聲波清洗器等均為國(guó)產(chǎn)常規(guī)儀器。

1.3 毒死蜱殘留量GC檢測(cè)

以1702-MP8型電子天平準(zhǔn)確稱取97%毒死蜱原藥0.010 3 g于10 mL容量瓶，加入丙酮，定容得到1 000 mg/L毒死蜱標(biāo)樣工作母液。按照梯度稀釋法，分別配制0.01、0.10、0.50、1.00、2.00 mg/L溶液，儀器穩(wěn)定后分別由低濃度到高濃度進(jìn)樣GC分析，每濃度3次重復(fù)，以毒死蜱濃度為X，峰面積為Y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

菜心毒死蜱殘留量GC測(cè)定前處理方法參考GB/T 5009.20-2003《食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的測(cè)定方法》，稍加改進(jìn)以便更加適合實(shí)際條件。主要過程如下：無水硫酸鈉（分析純）150 ℃烘6 h，活性炭用3 mol/L鹽酸浸泡過夜過濾，洗至中性，120 ℃烘干。準(zhǔn)確稱取菜心樣品10.0 g，加二氯甲烷70.0 mL，用勻漿機(jī)勻漿后置于250 mL具塞三角瓶中，加無水硫酸鈉30～100 g脫水，劇烈振蕩后如有固體硫酸鈉存在，說明所加無水硫酸鈉已經(jīng)足夠。加活性炭0.2～0.8 g脫色，振蕩0.5 h，濾紙過濾，用30.0 mL二氯甲烷分3次洗滌濾渣，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮近干，用二氯甲烷定容至5.0 mL，保存待測(cè)，外標(biāo)法定量。

準(zhǔn)確稱取若干份未經(jīng)施用農(nóng)藥的菜心葉片10.0 g，分別添加1 mL不同濃度的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其添加終濃度為0.01、0.05和0.10 mg/kg，按上述方法進(jìn)行前處理，按確定的GC方法檢測(cè)，計(jì)算添加回收率。

1.4 降解酶制劑對(duì)采后菜心毒死蜱殘留的降解效果測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]的方法，采集未經(jīng)施用農(nóng)藥的菜心葉片200 g，在2 L 48%毒死蜱乳油對(duì)水稀釋成1 200倍、12 000倍和120 000倍（即濃度分別為400、40、4 mg/L）的藥液中，并置于80 r/min的搖床中，5 min后取出，后用清水沖洗1次（不超過30 s），晾干水分后，分別置于降解酶制劑1倍、10倍和100倍溶液中，果蔬清洗劑A1 000倍溶液中（該產(chǎn)品沒有具體提供使用倍數(shù)，按洗滌劑常量偏高量使用），以清水作對(duì)照，浸泡時(shí)菜心務(wù)必全部浸沒。浸泡30 min，取出后按照常規(guī)洗滌方式漂洗1次，每個(gè)處理3次重復(fù)。按“1.3”方法進(jìn)行前處理（葉片和葉梗不分開）和GC檢測(cè)，評(píng)價(jià)降解酶制劑對(duì)毒死蜱的降解效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒死蜱殘留GC測(cè)定條件

經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，確定毒死蜱殘留GC檢測(cè)條件如下：色譜柱為DB-1701毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×1.0 μm），柱溫為100 ℃（1 min） ■250 ℃（10 min），柱流量3 mL/min，進(jìn)樣口溫度220 ℃，載氣為N2（純度99.999%），壓力20 psi，進(jìn)樣量2 μL，分流比2.0，吹掃時(shí)間0.75 min，吹掃量60 mL/min，H2為3 mL/min，空氣60 mL/min，NPD檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度280 ℃。在上述檢測(cè)條件下，毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間為13.680 min，峰形尖銳、對(duì)稱、穩(wěn)定。以毒死蜱濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1E7x-135 027，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，相關(guān)性顯著，方法可信。

添加回收率測(cè)定結(jié)果表明，在未施用農(nóng)藥的菜葉10.0 g中，添加不同濃度的毒死蜱標(biāo)樣各1 mL，使其添加終濃度分別為0.01、0.05和0.10 mg/kg時(shí)，毒死蜱的添加回收率分別為77.01%、88.91%和84.66%，變異系數(shù)為2.00%～7.85%，說明該分析方法穩(wěn)定可靠（表1）。

2.2 降解酶制劑對(duì)菜心毒死蜱殘留的采后降解效果

按“2.1”所確定的方法，48%毒死蜱EC用清水稀釋成有效成分400、40、4 mg/L藥液浸泡5 min后，清水沖洗后再用降解酶制劑稀釋液浸泡處理菜心表面的毒死蜱殘留，然后用GC法測(cè)定殘留濃度，評(píng)價(jià)酶制劑降解效果，結(jié)果見圖1和圖2。結(jié)果表明，菜心起始浸泡濃度為400、40、4 mg/L時(shí)，清水對(duì)照組毒死蜱殘留濃度分別為21.88、13.82、3.37 mg/L，而以降解酶制劑稀釋1倍（即原液）、10倍、100倍處理后，菜心毒死蜱殘留量均顯著低于清水對(duì)照組（圖1），但毒死蜱殘留去除率與處理起始濃度和制劑稀釋倍數(shù)有關(guān)，稀釋倍數(shù)為1倍和10倍時(shí)，總體差異不明顯，毒死蜱殘留去除率均保持在84%～96%，但稀釋100倍時(shí)，顯著低于前兩者。稀釋100倍時(shí)，起始處理濃度400、40、4 mg/L時(shí)，去除率分別為59.41%、79.59%和66.77%（圖2），說明起始處理濃度越高，去除率越低，同時(shí)也說明酶制劑對(duì)低殘留毒死蜱的降解作用更明顯。作為對(duì)照的果蔬清洗劑A稀釋1 000倍處理時(shí)，毒死蜱殘留量同樣明顯降低，但其不同于酶制劑的是，當(dāng)起始處理濃度為400 mg/L處理時(shí)，毒死蜱殘留去除率可達(dá)70.93%，但起始處理濃度降低至40 mg/L和4 mg/L時(shí)，殘留去除率分別降低至47.40%和40.65%（圖2）。endprint

3 結(jié)論與討論

作為高毒有機(jī)磷農(nóng)藥的替代品種，毒死蜱應(yīng)用廣泛，但其安全性一直是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的重點(diǎn)[9-11]。本試驗(yàn)在確定菜心毒死蜱殘留GC分析方法的基礎(chǔ)上，研究了降解酶制劑對(duì)采后菜心毒死蜱的降解處理效果。結(jié)果表明，該降解酶制劑性能較穩(wěn)定，適應(yīng)范圍較寬，實(shí)際應(yīng)用時(shí)，適宜稀釋倍數(shù)為10～100倍，對(duì)4～400 mg/L菜心毒死蜱殘留可有效去除59%～92%。

農(nóng)藥殘留降解酶制劑的稀釋倍數(shù)決定降解效果和使用成本。本研究結(jié)果表明，供試降解酶制劑對(duì)菜心毒死蜱殘留的降解去除效果，主要與毒死蜱起始濃度和降解酶制劑稀釋倍數(shù)相關(guān)。在試驗(yàn)中，當(dāng)酶制劑稀釋倍數(shù)在1倍和10倍時(shí)，菜心中毒死蜱起始處理濃度為400 mg/L時(shí)，去除率均在85%以上，起始處理濃度為40 mg/L時(shí)，去除率為91%以上，差異不明顯；但酶制劑稀釋倍數(shù)提高到100倍時(shí)，在毒死蜱起始處理濃度為400 mg/L高濃度時(shí)，殘留毒死蜱去除率不到60%，但在起始處理濃度為40 mg/L和4 mg/L時(shí)，殘留毒死蜱去除率分別為79.59%和66.77%。今后仍需深入研究降解效率與殘留濃度和稀釋倍數(shù)之間的關(guān)系，以指導(dǎo)降解酶制劑的實(shí)踐使用。

生物酶制劑的特點(diǎn)之一是能夠?qū)Φ蜌埩舻哪繕?biāo)物質(zhì)同樣有較好的去除作用[12，13]。本研究中，處理起始處理濃度40 mg/L和4 mg/L時(shí)，果蔬清洗劑A稀釋1 000倍對(duì)菜心樣品殘留毒死蜱的去除率僅為47.40%和40.65%，但供試酶制劑稀釋100倍時(shí)仍有79.59%和66.77%的去除率。這個(gè)結(jié)果一方面說明供試酶制劑可能具有與清洗劑完全不同的去除機(jī)制，另一方面，從解決實(shí)際問題的角度出發(fā)，酶制劑這種特性更具有實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)橐话闱闆r下，菜心等果蔬農(nóng)產(chǎn)品中的毒死蜱等有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量一般在10 mg/kg以下，從保障消費(fèi)者健康的角度出發(fā)，如果研制開發(fā)的生物酶制劑能顯著降解低殘留毒死蜱時(shí)，則更具有實(shí)用價(jià)值。本研究結(jié)果充分體現(xiàn)了所研制的生物降解酶制劑對(duì)低殘留農(nóng)藥的降解作用，值得進(jìn)一步研究開發(fā)。然而，本研究?jī)H測(cè)定了供試降解酶制劑對(duì)毒死蜱的降解效果，對(duì)于其他有機(jī)磷或其他化學(xué)農(nóng)藥的降解效果如何，仍有待進(jìn)一步深入研究。此外，今后應(yīng)繼續(xù)研究?jī)?yōu)化降解酶制劑，以提高降解效果，降低使用成本，使其更具有實(shí)際應(yīng)用前景。

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