金雀花異黃酮提取工藝研究

張妮 王家勝 孔琪 余正文 乙引

摘要：通過單因素試驗和正交試驗對金雀花（Parochetus communis Buch.）異黃酮提取工藝中提取溶劑類型、提取劑體積分數(shù)、提取時間、提取溫度、料液比等影響異黃酮提取率的因素進行了探討，應(yīng)用紫外分光光度法測定不同提取條件下金雀花異黃酮的含量。確定金雀花異黃酮最佳提取工藝參數(shù)為甲醇體積分數(shù)65%，提取溫度90 ℃，料液比為1∶40（m/V，g∶mL），提取2次，每次2.0 h，在此提取工藝條件下，金雀花總異黃酮得率為2.38%。

關(guān)鍵詞：金雀花（Parochetus communis Buch.）；異黃酮；提取工藝；正交試驗設(shè)計

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2715-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.041

Study on Extraction Technology of Isoflavones in Parochetus communis Buch.

ZHANG Ni， WANG Jia-sheng， KONG Qi， YU Zheng-wen， YI Yin

（College of Life Sciences， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China）

Abstract： Extraction technology of isoflavone in Parochetus communis have been studied with single factor test and orthogonal experimental design. Effects of extraction solvents types， the volume fraction of extraction solvent， the extraction time， solid-liquid ratio on extraction rate of isoflavones were investigated. The content of isoflavones in Parochetus communis under different extraction conditions was measured by ultraviolet spectrophotometer.The optimum extraction conditions for isoflavones in Parochetus communis were established as follows：65% methanol（V/V） as solvent， solid-liquid ratio 1∶40（m/V，g∶mL） ，reflux extraction at 90 ℃ for 2 times and 2.0 h for each time. The extraction rate of isoflavones in Parochetus communis was 2.38% under above-mentioned optimum extraction procession.

Key words： Parochetus communis Buch.； isoflavone； extraction technology； orthogonal experimental design

藥食同源植物金雀花（Parochetus communis Buch.）別名生血草、一顆血，為蝶形花科（Papilionaceae）金雀花屬（Parochetus）植物，主要分布在貴州省興仁縣、興義市、普安縣、畢節(jié)市、遵義市等地，生于1 800 m的山谷草地，云南、緬甸、印度、斯里蘭卡、印尼也有分布。該藥材性酸、澀、溫，常用于治療創(chuàng)傷出血、跌打骨折、外傷發(fā)熱等。貴州省苗族民間用金雀花治療各種毒瘡，具有獨特的療效[1，2]。金雀花是云南西雙版納傣族同胞重要的野菜品種之一[3]，貴州省遵義市也有食用金雀花的習慣。

異黃酮具有抗氧化、抗紫外、降血糖和抗腫瘤等多種藥理活性[4，5]。如芒柄花素是植物雌激素，其大量存在于蝶形花科植物中，如黃芪、紅三葉草，具有治療心血管疾病[6]、加速傷口愈合[7]、抗高血壓、抗氧化和雌激素[8，9]的作用。目前，金雀花中異黃酮提取工藝研究鮮見報道。本研究以異黃酮含量為指標，通過正交試驗設(shè)計優(yōu)選異黃酮類化學成分的提取工藝，為金雀花的開發(fā)和合理利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料金雀花于2012年6月采自貴州省興仁縣，經(jīng)貴陽中醫(yī)學院陳德媛教授鑒定為蝶形花科金雀花屬植物金雀花的全草。其標本保存于貴州師范大學生命科學學院。芒柄花素為自制，結(jié)構(gòu)經(jīng)1HNMR、13CNMR、EI-MS鑒定，純度經(jīng)HPLC檢測達到95%以上。

1.2 試劑與儀器

752E UV-Vis Spectrophotometer（天津普瑞斯儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），EYELA N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（倍捷科技有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司），AB135-S型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），DHG-9140A型鼓風干燥箱（上?；厶貎x器制造有限公司）；石油醚、甲醇、無水乙醇為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 金雀花的前處理及脫脂 取金雀花樣品于60 ℃烘箱中干燥3 h，粉碎后移入干燥器中。分別稱取金雀花1.000 0 g，用濾紙包好，置于索氏提取器中，以石油醚為脫脂劑，于85 ℃脫脂6 h，充分除去樣品中游離脂類和脂溶性色素，再將濾紙包置于烘箱中60 ℃烘干。

1.3.2 金雀花異黃酮提取液的制備 取上述已脫脂好的金雀花樣品，采用回流提取法進行提??；減壓回收溶劑得到提取物浸膏，待用。

1.3.3 測定波長的選擇 精密量取供試品溶液和對照品溶液適量，在190～800 nm對供試樣品溶液和對照品溶液掃描，供試品和對照品均在249 nm處有最大吸收峰，故確定249 nm為測定波長。

1.3.4 標準曲線的制作 精密稱取芒柄花素標準品0.000 50 g，置于25 mL容量瓶中，以95%的甲醇溶解，定容至刻度，搖勻。分別精密吸取150、200、300、400、500、600、700 μL標準品溶液，置于10 mL容量瓶中，再各加甲醇1 mL，最后用蒸餾水定容至刻度，搖勻。以1 mL甲醇加蒸餾水定容至10 mL為空白對照，在249 nm處測定其吸光度。以吸光度（y）為縱坐標，對照品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程 y=0.041 6x-0.005 3，R2=0.999 5（n=7），表明芒柄花素濃度為3～14 μg/mL時呈良好的線性關(guān)系。

1.3.5 金雀花異黃酮提取率測定 取“1.3.2”浸膏用甲醇定容至一定體積得樣品提取液，搖勻，按“1.3.3”的方法進行異黃酮含量的測定，再根據(jù)標準曲線計算得樣品中異黃酮質(zhì)量，異黃酮提取率=m/M×100%。式中，m為樣品中異黃酮質(zhì)量；M為金雀花粉末質(zhì)量。

1.3.6 單因素試驗及正交試驗設(shè)計 試驗考察了水、不同體積分數(shù)乙醇及甲醇對金雀花異黃酮提取率的影響。在此基礎(chǔ)上，通過對提取參數(shù)中甲醇體積分數(shù)、回流溫度、料液比（m/V，g∶mL，下同）及回流時間等影響金雀花異黃酮提取率的因素進行單因素試驗及正交試驗，確定最佳的工藝參數(shù)（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取溶劑對異黃酮得率的影響 取金雀花樣品1.000 0 g，分別以水、甲醇、乙醇為提取溶劑，在溫度為85 ℃，料液比為1∶20，提取2次，每次2.0 h的條件下，考察提取溶劑對金雀花異黃酮得率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，金雀花中異黃酮得率呈下降趨勢。當甲醇體積分數(shù)為60%時，異黃酮得率最高，明顯高于乙醇提取，遠高于水提取。說明在此濃度下，異黃酮類化合物在甲醇溶液中的溶解度要高于在乙醇溶液和水中的溶解度。由于異黃酮類化合物具有多個苯環(huán)和酚羥基結(jié)構(gòu)，苯環(huán)為非極性基團，而酚羥基為親水基團，具有極性，所以金雀花異黃酮適宜用一定碳鏈長度的適宜極性的混合溶劑提取。當甲醇體積分數(shù)超過60%時，提取液的顏色加深，各種雜質(zhì)的溶出液增多，給后續(xù)的紫外分光光度計測量帶來較大的干擾。因此，選擇體積分數(shù)55%～65%的甲醇溶液作為進一步優(yōu)化的范圍。

2.1.2 回流時間對異黃酮得率的影響 取金雀花樣品1.000 0 g，以體積分數(shù)60%的甲醇為提取溶劑，提取溫度為85 ℃，料液比為1∶20，提取2次，考察回流時間對異黃酮提取過程的影響，試驗結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，在回流時間低于2.0 h時，異黃酮得率隨著時間的延長而大幅度增加，大于2.0 h后，異黃酮得率隨回流時間的延長而降低。因此選取回流時間為1.5～2.5 h即可。

2.1.3 回流溫度對異黃酮得率的影響 取金雀花樣品1.000 0 g，以體積分數(shù)60%的甲醇為提取溶劑，料液比為1∶20，提取2次，每次2.0 h的條件下，考察回流溫度對異黃酮得率的影響，試驗結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，異黃酮得率大體趨勢呈隨回流溫度升高而提高的趨勢。說明溫度越高，分子運動越快，滲透、擴散、溶解速度加快，使異黃酮類化合物更容易從細胞中轉(zhuǎn)移到溶劑中。但溫度過高，異黃酮類可能會被氧化或者其中的成分被破壞。因此，選擇回流溫度80～90 ℃為進一步優(yōu)化的范圍。

2.1.4 料液比對異黃酮得率的影響 取金雀花樣品1.000 0 g，以體積分數(shù)60%的甲醇為提取溶劑，在溫度為85 ℃，提取2次，每次2.0 h的條件下，考察料液比對異黃酮得率的影響，試驗結(jié)果見圖4。如圖4所示，隨著溶劑用量的增大，異黃酮得率逐漸增大，當溶劑用量再增大時，異黃酮得率處于下降趨勢。一般來說，溶劑用量越大，提取率越大；但是，過大的溶劑用量會溶解出更多的雜質(zhì)，也會造成溶劑和能源的浪費，并給后序的處理帶來困難。綜合考慮異黃酮得率、溶劑用量和能源損耗等因素，選擇料液比（1∶20）～（1∶40）為進一步優(yōu)化的范圍。

2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以金雀花干粉為樣品，對影響提取效果的主要因素進行L9（43）正交試驗，同時對試驗結(jié)果進行了方差分析，結(jié)果如表2所示。由表2的R可以看出，各因素對試驗結(jié)果影響的主次順序為料液比（D）、回流時間（B）、甲醇體積分數(shù)（C）、回流溫度（A），且方差分析結(jié)果表明，回流時間及料液比對浸出物得率影響顯著（P<0.05）。依據(jù)正交試驗可得最佳工藝條件為A3B2C3D3，即體積分數(shù)65%的甲醇為溶劑，回流溫度90 ℃，加熱回流2.0 h，料液比1∶40，在此提取工藝條件下，金雀花異黃酮得率的驗證結(jié)果為2.38%。

3 小結(jié)

金雀花是一種藥食兼用的重要特色植物資源，含有豐富的異黃酮，值得深入研究開發(fā)應(yīng)用。本研究通過單因素試驗及正交試驗，確定金雀花異黃酮最佳提取工藝參數(shù)為甲醇體積分數(shù)65%，提取溫度90 ℃，料液比1∶40，提取2次，每次2.0 h，在此提取工藝條件下，金雀花總異黃酮得率為2.38%。

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