謝炎福 杜苗苗 張優(yōu)儀

摘要：以紅曲霉（Monascus）作為發(fā)酵菌株，中藥紅花（Carthamus tinctorius）作為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行了雙向發(fā)酵試驗(yàn)。結(jié)果表明，紅花對(duì)于紅曲霉的生長和次級(jí)代謝產(chǎn)物莫那可林K （Monacolin K）的積累具有促進(jìn)作用，同時(shí)基質(zhì)中紅花黃色素提取率也得到了提高，經(jīng)過對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，雙向發(fā)酵的最佳工藝條件為紅曲霉接種量6%，紅花添加量3%，葡萄糖添加量6%，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵11 d。在此工藝條件下，Monacolin K的產(chǎn)量達(dá)到25.23 mg/L，比未加紅花的對(duì)照提高了32.6%；紅花黃色素提取率為5.18%，比未加紅曲霉的對(duì)照提高了8.1%。

關(guān)鍵詞：紅曲霉（Monascus）；紅花（Carthamus tinctorius）；雙向發(fā)酵；紅花黃色素；Monacolin K

中圖分類號(hào)：TQ925+.7；Q93 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）11-2718-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.042

Preliminary Study on Bi-fermentation of Monascus and Carthamus tinctorius

XIE Yan-fu，DU Miao-miao，ZHANG You-yi

（Department of Life Science， Luoyang Normal University， Luoyang 471022， Henan， China）

Abstract： The bi-fermentation experiment，Monascus as fermentation strain and traditional Chinese medicine Carthamus tinctorius as medium，was carried out. The result showed that，Carthamus promoted the growth of Monascus and the yield of Monacolin K，and simultaneously the extraction rate of yellow pigment in Carthamus tinctorius was increased. Through optimization of fermentation condition， the optimal technological parameters for production of yellow pigment in Carthamus tinctorius and Monacolin K in Monascus were obtained， that was Monascus inoculum 6%，Carthamus tinctorius 3%，glucose 6%， fermentation temperature 28 ℃，and aerobic fermentation time 11 d.Under this condition，the yield of Monacolin K was up to 25.23 mg/L， increased by 32.6% than the control without addition of Carthamus tinctorius， meanwhile yellow pigment was up to 5.18%， increased by 8.1% than the control without addition of Monascus.

Key words： Monascus； Carthamus tinctorius； bi-fermentation； yellow pigment in Carthamus tinctorius； Monacolin K

紅曲霉（Monascus）的使用在中國具有悠久的歷史，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域，紅曲霉能產(chǎn)生紅曲色素、莫那可林K（Monacolin K）、γ-氨基丁酸等多種生物活性成分，具有很高的保健及藥用價(jià)值[1，2]。紅花（Carthamus tinctorius）具有活血化淤、抗腫瘤、抗菌等功效[3，4]，其生物活性成分主要為紅花黃色素[5]，紅花黃色素的傳統(tǒng)提取工藝為水浸法，提取率較低。紅曲霉和紅花在藥性機(jī)理上具有較高的相似性[6]，紅曲霉能產(chǎn)生淀粉酶、葡萄糖苷酶、纖維素酶等豐富的酶系[7]，能有效破除植物類中藥細(xì)胞壁和果膠類物質(zhì)形成的物理屏障，使有效活性成分溶出，從而提高提取效率，具有對(duì)中草藥活性成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化、修飾以及產(chǎn)生新的活性物質(zhì)的巨大潛力。將紅曲霉與紅花一起共同構(gòu)建雙向發(fā)酵體系產(chǎn)生的藥性菌質(zhì)比兩者分別入藥更能得到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的效果[8]。本研究在前期中藥篩選的基礎(chǔ)上，利用紅花作為紅曲霉發(fā)酵的藥性基質(zhì)，旨在探討通過雙向發(fā)酵提高紅花活性成分紅花黃色素提取率以及紅曲霉中Monacolin K等有效活性成分含量的可行性，并進(jìn)行發(fā)酵條件的初步優(yōu)化，為紅曲霉藥性基質(zhì)雙向發(fā)酵的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 紅曲霉為洛陽師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存菌種。紅花購自洛陽醫(yī)藥城，將紅花于60 ℃培養(yǎng)箱中干燥至質(zhì)量恒定，用實(shí)驗(yàn)室小型粉碎機(jī)粉碎過120目篩備用。

1.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 參照文獻(xiàn)[9]的培養(yǎng)基配方并進(jìn)行適當(dāng)?shù)母膭?dòng)，改動(dòng)后的培養(yǎng)基配方：葡萄糖10 g，紅花粉20 g，硝酸鈉3 g，酵母提取物1 g，磷酸氫二鉀1 g，7水合硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，7水合硫酸亞鐵0.01 g，pH 5.6，用自來水定容至1 L。

1.1.3 試劑 葡萄糖、硝酸鈉、酵母膏、磷酸氫二鉀、7水合硫酸鎂、氯化鉀、7水合硫酸亞鐵、乙醇、石油醚等均為分析純。紅花黃色素純品（純度大于99%）；Monacolin K純品（純度大于99%）。以上藥品均購自鄭州三鑫化學(xué)試劑有限公司

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：UV2000，島津；水浴恒溫振蕩器：SHZ-A，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱：DHP-9052，上海申賢恒溫設(shè)備廠；小型固體樣品粉碎機(jī)：FW-80，金壇市春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵種子液的制備 將經(jīng)活化的紅曲霉斜面孢子用無菌水洗下，倒入含0.05%吐溫-80生理鹽水的三角瓶中，三角瓶中預(yù)先裝有數(shù)十粒玻璃珠，在搖床上振蕩，充分打散孢子，制成孢子濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸液，即為紅曲霉種子液。

1.3.2 發(fā)酵工藝流程 將80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，于121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻后按照6%的比例接入預(yù)先制好的紅曲霉孢子懸液，在180 r/min、30 ℃搖床上培養(yǎng)3 d，然后降低溫度至28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2～12 d（采用變溫發(fā)酵更有利于Monacolin K的產(chǎn)生[10]），隔天定時(shí)帶瓶稱質(zhì)量，測(cè)量各項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液過濾，烘干，稱量紅曲霉菌絲體生物量。

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn) 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)包括紅曲霉接種量：0、3%、6%、9%、12%；葡萄糖添加量：0、3%、6%、9%、12%；紅花添加量：0、1%、2%、3%、4%、5%；發(fā)酵時(shí)間：30 ℃發(fā)酵3 d后，28℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)2～12 d；溫度：26、28、30、32 ℃。每個(gè)處理3次重復(fù)，分別測(cè)定紅曲霉菌絲體生物量，以Monacolin K含量、紅花黃色素提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，培養(yǎng)方法同上，每次改變一個(gè)條件，測(cè)定不同條件下各指標(biāo)的變化情況。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn) 選用L9（34）正交設(shè)計(jì)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取紅曲霉接種量、培養(yǎng)溫度、紅花添加量、葡萄糖添加量等4個(gè)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，因素與水平見表1，并以紅花黃色素提取率、Monacolin K含量為考察指標(biāo)確定最優(yōu)發(fā)酵條件，每個(gè)試驗(yàn)2個(gè)重復(fù)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及分析方法

紅曲霉菌絲體生物量測(cè)定：采用重量法，將發(fā)酵液連帶菌絲球一起在3 000 r/min的搖床上離心15 min，收集沉淀，離心2次，將2次的沉淀物混合，在60 ℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，稱量。

Monacolin K含量測(cè)定：參照文獻(xiàn)[10]的方法，取6 mL發(fā)酵液，加入14 mL甲醇，搖床振蕩（30 ℃、200 r/min）2.5～3.0 h后，8 000 r/min離心20 min，上清液用有機(jī)濾膜過濾后，在236 nm波長處測(cè)定其吸光度。

紅花黃色素濃度測(cè)定：參照薛偉明等[11]的方法并略有改動(dòng)。紅花黃色素提取率的計(jì)算公式[12]：紅花黃色素提取率=[（紅花黃色素濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積）/紅花質(zhì)量]×l00%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，多重比較采用最小顯著差數(shù)法（Least significant difference，LSD）法。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

在紅曲霉接種量6%，葡萄糖添加量1%，紅花添加量2%，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，30 ℃的條件下培養(yǎng)3 d，然后降低溫度至28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2～12 d，以考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，紅花黃色素提取率在發(fā)酵初期變化很小，發(fā)酵3 d后開始明顯上升，至發(fā)酵7 d時(shí)達(dá)到高峰，維持4 d后至發(fā)酵第11天開始下降，紅曲霉菌絲體生物量的變化與紅花黃色素提取率的變化基本一致，呈高度正相關(guān)。紅曲霉在葡萄糖存在的情況下，優(yōu)先利用培養(yǎng)基中的葡萄糖作為碳源和能量來源，初期紅花黃色素主要來源于水的提取作用，葡萄糖將要耗盡時(shí)紅曲霉大量合成淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和其他酶類，分解紅花中的糖類、脂肪和纖維素類以供自身的生長，隨著這些營養(yǎng)成分的分解利用，打破了細(xì)胞壁和蛋白質(zhì)的阻礙，有利于紅花黃色素從胞內(nèi)溶出，后期紅花黃色素提取率下降可能是由于被紅曲霉轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì)或者代謝作為營養(yǎng)成分利用的結(jié)果。

Monacolin K含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，發(fā)酵初期幾乎測(cè)不到Monacolin K，Monacolin K含量高峰出現(xiàn)時(shí)間延后于菌體的產(chǎn)量高峰，說明Monacolin K是紅曲霉的次生代謝產(chǎn)物，只有在紅曲霉菌絲體量增加至平穩(wěn)期后Monacolin K才大量合成。Monacolin K含量在發(fā)酵13 d時(shí)達(dá)到最大值，而紅花黃色素提取率在發(fā)酵7 d時(shí)達(dá)到最大值，在發(fā)酵第11天，兩者都相對(duì)較大，故選擇最佳雙向發(fā)酵時(shí)間為11 d，即30 ℃培養(yǎng)3 d，然后降低溫度至28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)8 d。

2.2 紅花添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

在紅曲霉接種量6%，葡萄糖添加量1%，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，30 ℃培養(yǎng)3 d，然后降低溫度至28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)8 d的發(fā)酵條件下，考察紅花添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著紅花添加量的增大，紅曲霉菌絲體生物量、Monacolin K含量和紅花黃色素提取率均經(jīng)歷了一個(gè)先增長后降低的過程，均在紅花添加量3%時(shí)達(dá)到最大值。說明一定量的紅花對(duì)于紅曲霉的生長和其有效活性成分Monacolin K的產(chǎn)生具有一定的促進(jìn)作用。這可能是因?yàn)榧t花含有紅花甙、肉桂酸、月桂酸等多種有效成分，刺激了紅曲霉的代謝活動(dòng)，從而分泌大量的相關(guān)酶類分解紅花中的變性蛋白質(zhì)作為自身的營養(yǎng)物質(zhì)，提高了紅花黃色素的溶出率。

2.3 紅曲霉接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

在葡萄糖添加量1%，紅花添加量3%，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，30 ℃培養(yǎng)3 d，然后降低溫度至28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)8 d的發(fā)酵條件下，考察紅曲霉接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著紅曲霉接種量的增大，紅曲霉菌絲體生物量增加，紅花黃色素提取率和Monacolin K含量則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，紅花黃色素提取率在紅曲霉接種量6%時(shí)達(dá)到最大，Monacolin K含量則在紅曲霉接種量9%時(shí)達(dá)到最大。說明紅花黃色素提取率和Monacolin K含量并不一直隨著紅曲霉菌絲體生物量的提高而增大，接種量過大或過小均不利于Monacolin K的生成以及紅花黃色素提取率的提高。紅曲霉接種量增大，菌體代謝旺盛，分泌大量的胞外酶類，有利于發(fā)酵基質(zhì)的利用和菌體的生長，但是接種量過大，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液過于黏稠，影響溶氧含量，最終影響產(chǎn)物的合成。

2.4 葡萄糖添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

在紅曲霉接種量6%，紅花添加量3%，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，30 ℃培養(yǎng)3 d，然后降低溫度至28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)8 d的發(fā)酵條件下，考察葡萄糖添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著葡萄糖添加量的增加，Monacolin K含量、紅曲霉菌絲體生物量、紅花黃色素提取率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，說明葡萄糖過高或過低均不利于紅曲霉的生長以及相關(guān)酶類和次生代謝產(chǎn)物的積累。Monacolin K含量和紅曲霉菌絲體生物量均在葡糖糖添加量為6%時(shí)達(dá)到最大值，而紅花黃色素提取率在葡萄糖添加量為3%時(shí)達(dá)到最大值，雖然在葡萄糖添加量6%時(shí)有所下降，但并不是很明顯，所以仍取6%作為發(fā)酵時(shí)的適宜添加量。

2.5 溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

在紅曲霉接種量6%，葡萄糖添加量6%，紅花添加量3%，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，30 ℃培養(yǎng)3 d，然后調(diào)節(jié)至設(shè)定溫度（26～32 ℃）繼續(xù)培養(yǎng)8 d的發(fā)酵條件下，考察溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，紅曲霉菌絲體生物量和紅花黃色素提取率均隨著溫度的上升而逐漸提高，不加紅曲霉的對(duì)照組紅花黃色素提取率也呈現(xiàn)同樣的增加趨勢(shì)，但在同樣的溫度條件下，經(jīng)過紅曲霉發(fā)酵的試驗(yàn)組紅花黃色素提取率高于未經(jīng)紅曲霉發(fā)酵的對(duì)照組。說明較高的溫度有利于紅花黃色素在水中的溶解，另一方面還說明較高的溫度有利于紅曲霉對(duì)紅花進(jìn)行發(fā)酵，這可能和紅曲霉纖維素酶、蛋白酶、果膠酶的活性或紅曲霉發(fā)酵液在不同溫度下酶類的成分構(gòu)成有關(guān)系，雙向發(fā)酵過程呈現(xiàn)的紅花黃色素提取率的提高是紅花黃色素溶出率隨溫度提高和紅曲霉的發(fā)酵共同作用的結(jié)果。Monacolin K含量和紅花黃色素提取率的變化趨勢(shì)相反，隨著溫度的上升，Monacolin K含量呈現(xiàn)一個(gè)逐漸下降的趨勢(shì)，但仍高于相應(yīng)的不加紅花的對(duì)照組。說明低溫有利于Monacolin K的生成。綜合兩者的溫度曲線，在28 ℃時(shí)兩者產(chǎn)量均較高，所以確定28 ℃作為雙向發(fā)酵的控制溫度。

2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

相對(duì)于其他4個(gè)因素，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響比較一致，所以固定發(fā)酵11 d作為正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)條件。由表2可知，各因素對(duì)紅花黃色素提取率影響的主次順序?yàn)锽、C、A、D，其優(yōu)化組合為A2B3C2D1，即紅曲霉接種量6%、溫度30 ℃、紅花添加量3%、葡萄糖添加量3%時(shí)紅花黃色素提取率取得最大值；各因素對(duì)Monacolin K含量影響的主次順序?yàn)锽、C、D、A，優(yōu)化組合為A2B1C3D2，即紅曲霉接種量6%、溫度26 ℃、紅花添加量4%、葡萄糖添加量6%時(shí)Monacolin K含量最高。經(jīng)方差分析得出，紅曲霉接種量、溫度、紅花添加量及葡萄糖添加量4個(gè)因素對(duì)Monacolin K含量均有極顯著影響（P<0.01）；接種量、溫度和紅花添加量對(duì)紅花黃色素提取率有極顯著影響，葡萄糖添加量對(duì)紅花黃色素提取率影響不顯著（P>0.05）。

由多重比較分析可知，Monacolin K含量在紅花添加量為3%和4%時(shí)無顯著差異，故雙向發(fā)酵的紅花添加量取3%，即C2；因葡萄糖添加量對(duì)紅花黃色素提取率無顯著影響，而Monacolin K含量在葡萄糖添加量為6%時(shí)最佳，故雙向發(fā)酵的葡萄糖添加量取6%，即D2；Monacolin K含量和紅花黃色素提取率的最佳條件在溫度方面差別很大，相對(duì)來說在B2水平，兩者均取得較高的產(chǎn)量。所以綜合考慮雙向發(fā)酵的最佳組合為A2B2C2D2，即紅曲霉接種量6%，發(fā)酵溫度28 ℃，紅花添加量3%，葡萄糖添加量6%。由于最佳發(fā)酵條件A2B2C2D2未出現(xiàn)在正交表中，故需要進(jìn)行補(bǔ)充驗(yàn)證試驗(yàn)，在此條件下，驗(yàn)證的結(jié)果為紅花黃色素提取率5.18%，比未利用紅曲霉發(fā)酵的對(duì)照組（4.79%）提高了8.1%，Monacolin K含量達(dá)到25.23 mg/L，比未加紅花的對(duì)照組（19.02 mg/L）提高了32.6%。

3 小結(jié)

紅花的適宜添加對(duì)于紅曲霉的生長和次級(jí)代謝產(chǎn)物Monacolin K的積累具有促進(jìn)作用，紅曲霉以紅花作為藥性基質(zhì)提高了紅花黃色素的提取率，紅曲霉和紅花雙向發(fā)酵能同時(shí)提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量和紅花黃色素的提取率；經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化，最佳工藝條件為：紅曲霉接種量6%，紅花添加量3%，葡萄糖添加量6%，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵11 d。在此最佳條件下，Monacolin K的產(chǎn)量達(dá)到25.23 mg/L，比未加紅花的對(duì)照組提高了32.6%；紅花黃色素提取率為5.18%，比未利用紅曲霉發(fā)酵的對(duì)照組提高了8.1%。紅曲霉和紅花雙向發(fā)酵相互影響，有可能對(duì)現(xiàn)有成分進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化或產(chǎn)生了新的活性成分，有待繼續(xù)在這一方面進(jìn)行深入研究。

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