吳曉剛 劉彬球 陳孝權(quán) 張偎 胡成蕓 凌登猛

摘要：采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（UPLC-ESI-MS/MS），于多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下建立了茶葉中洛伐他汀的定性定量分析方法。樣品經(jīng)甲醇超聲提取，Waters Acquity UPLC？誖BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）柱分離，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。在0.000 8～0.200 0 μg/mL間有良好的線性關(guān)系（R2>0.999 0），檢出限為0.000 2 μg/mL；在3個添加濃度水平下，平均加標回收率為98.54%～ 109.86%；相對標準偏差（RSD，n=6）為1.45%～3.09%。該方法準確、可靠、靈敏度高，適用于茶葉中洛伐他汀含量的檢測。

關(guān)鍵詞：茶；超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜；洛伐他汀；多反應(yīng)監(jiān)測

中圖分類號：O657.63 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2732-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.045

Determination of Lovastatin in Tea Using Ultra Performance Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry

WU Xiao-gang， LIU Bin-qiu， CHEN Xiao-quan， ZHANG Wei， HU Cheng-yun， LING Deng-meng

（Technology Center Laboratory of Menghai Tea Industry Co.， Ltd， TAETEA Group， Menghai 666200， Yunnan， China）

Abstract： An UPLC-ESI-MS/MS method with multiple reaction monitoring （MRM） mode was developed for the qualitative and quantitative analysis of lovastatin in tea. The sample preparation was based on ultrasonic-assisted extraction，Waters Acquity UPLC？誖BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm） column separation and UPLC-MS/MS determination. The method showed a good linearity （R2>0.999 0） in the 0.000 8～0.200 0 μg/mL and LOD of 0.000 2 μg/mL. For three spiked levels，the average recoveries were from 98.54% to 109.86%， and the relative standard deviations （RSD，n=6） were from 1.45% to 3.09%. The method was reliable， accurate， sensitive and appropriate for the determination of lovastatin in tea.

Key words： tea； UPLC-ESI-MS/MS； lovastatin； multiple reaction monitoring （MRM）

1979年， Endo等[1]從Monascus ruber的培養(yǎng)液中分離出抑制HMG-CoA（3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A）還原酶活性的Monacolin K，同時 Alberts等[2]于1980 年也從Aspergillus terreus中分離出與Monacolin K相同的物質(zhì)Mevinolin，后命名為洛伐他?。↙ovastatin），由Merk公司率先制成藥品上市。洛伐他汀是人體膽固醇合成中的關(guān)鍵酶HMG-CoA還原酶的抑制劑，因其療效好、副作用低，目前已被廣泛地應(yīng)用于臨床高血脂癥等疾病的治療。

普洱茶是以云南大葉茶[Camellia sinensis （Linn.） var. assamica （Masters） Kitamura]的曬青毛茶為原料，在微生物的作用下，經(jīng)漫長的自然陳化或快速人工渥堆后發(fā)酵而成。目前，能產(chǎn)洛伐他汀的微生物已見報道[3]，如曲霉菌（Aspergillus）、紅曲霉菌（Monascus）、毛霉菌（Mucor）和青霉菌（Penicillium）等。Hwang等[4]首先在普洱茶中發(fā)現(xiàn)有洛伐他汀的存在；隨后，Yang等[5]研究指出洛伐他汀是在普洱茶中發(fā)現(xiàn)的惟一的他汀類化合物，在乙酸乙酯提取物中含量較高，且全部以內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)存在，而在100 ℃普洱茶水提取物中含量較低，以內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)和羥酸結(jié)構(gòu)兩種形式存在；謝春生等[6]在普洱熟茶中也檢測出了洛伐他汀，洛伐他汀含量與普洱茶發(fā)酵程度成正比，其提取工藝和產(chǎn)品（制劑）也申請了國家發(fā)明專利。

國內(nèi)對洛伐他汀的測定始于20世紀90年代，最常見也是最典型的方法是高效液相色譜法，此外還有薄層掃描法和紫外分光光度法等。薄層層析法受試驗條件干擾較大，方法的回收率較低；用紫外分光光度法對待測物檢測專屬性不強，準確度也不高；高效液相色譜法檢測時間較長，檢測效率低下。茶葉基質(zhì)的復(fù)雜性增加了洛伐他汀含量檢測的難度，近年來發(fā)展起來的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）技術(shù)具有檢測靈敏度高、適用范圍廣、分析速度快以及可有效排除復(fù)雜基質(zhì)干擾等優(yōu)點，因而成為首選的檢測手段。但目前國內(nèi)尚未見利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-ESI-MS/MS）檢測茶葉中洛伐他汀含量的文獻報道。因此，本工作通過對茶葉中洛伐他汀物質(zhì)的提取、凈化及色譜-質(zhì)譜檢測條件進行研究，建立了UPLC-ESI-MS/MS測定茶葉中洛伐他汀含量的方法。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；甲酸（色譜純，美國Tedia公司）；去離子水（昆明娃哈哈啟力飲料有限公司）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；洛伐他汀標準品（純度>98%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2 主要儀器

ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司）；WATERS XEVO TQD串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（沃特世科技有限公司）；高效粉碎機（上海嘉定糧油儀器有限公司）；臺式超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；超純水系統(tǒng)（成都康寧實驗專用純水設(shè)備廠）；漩渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 標準工作溶液配制及標準曲線 準確稱取洛伐他汀標準品10 μg，用甲醇配制濃度依次為0.000 8、0.001 6、0.003 2、0.006 4、0.012 5、0.025 0、0.050 0、0.100 0、0.200 0 μg/mL的洛伐他汀標準工作溶液，以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、響應(yīng)的峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線。

1.3.2 檢測條件 UPLC條件：Waters Acquity UPLC？誖BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；色譜柱溫度40 ℃，進樣室溫度為20 ℃；進樣量4 μL；流速0.3 mL/min；流動相A為去離子水（含體積分數(shù)為0.1%的甲酸），流動相B為乙腈；梯度洗脫程序：0.0～0.5 min，95%～30% A；0.5～3.0 min，30%～10% A；3.0～3.1 min，10%～95% A；3.1～6.0 min，95% A。

MS/MS條件：ESI+離子化模式；毛細管電壓為2.50 kV；離子源溫度為150 ℃；霧化氣和脫溶劑氣均為氮氣，碰撞氣為氬氣；脫溶劑氣溫度為400 ℃，流速為800 L/Hr；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。洛伐他汀離子對、錐孔電壓、碰撞能量及保留時間見表1。

1.3.3 樣品前處理 取普洱茶樣品，四分法縮分后取200 g，粉碎后過1 mm孔徑篩，混勻，備用。稱取磨碎試樣1 g（精確至0.001 g）于10 mL離心管中，加入5 mL甲醇，超聲提取20 min，期間每5 min振搖一次，離心后將上清液移入10 mL容量瓶內(nèi)；剩余茶渣繼續(xù)加入5 mL甲醇，重復(fù)提取一次；合并兩次上清液，定容刻度至10 mL。取1 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜后，供UPLC-MS/MS測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

文獻[7-9]利用C18色譜柱分離洛伐他汀均有較全面報道。Wang等[10]曾利用AcquityTM UPLC BEH C18柱對人體血漿中的洛伐他汀含量進行快速測定；Elzbieta等[11]采用Symmetry C18藥物中降低膽固醇水平的洛伐他汀含量進行檢測。故本試驗選用Waters Acquity UPLC？誖BEH C18柱（1.7 μm， 2.1 mm×50 mm），其采用1.7 μm小顆粒填料在更寬線速度范圍內(nèi)可獲得最佳的柱效，能顯著提升色譜柱的性能。洛伐他汀標準溶液離子色譜圖見圖1。

2.2 流動相的選擇

在液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用中，流動相的選擇除考慮色譜柱的分離效果外，還必須考慮待測物質(zhì)進入質(zhì)譜前的離子化效率，以便獲得最佳的分離度和最高的靈敏度。A流動相的甲酸可提供H+，維持目標離子質(zhì)子化狀態(tài)，增強洛伐他汀在流動相中的離子化程度，有助于提高檢測靈敏度。B流動相中的乙腈黏度低，樣品出峰峰形好，響應(yīng)值也高[12]。故本試驗選用0.1%甲酸水和純乙腈作流動相。

2.3 方法的線性范圍、檢出限及定量限

在最佳試驗條件下，本研究選取定量下限以上的不同濃度標準工作溶液進行液質(zhì)聯(lián)用分析，分別獲得各自的峰面積，通過建立樣品濃度與峰面積的標準曲線，得到線性方程為y=92 178.3x+162.3（R2=0.999 7）；以3倍信噪比計算檢出限（LOD），10倍信噪比計算定量限（LOQ）分別為0.000 2和0.000 7 μg/mL。

2.4 穩(wěn)定性考察

取0.1 μg/mL洛伐他汀標準工作溶液，于4 ℃下樣品管理器中保存，分別在0、4、8、12、16、20、24 h取樣進行日內(nèi)精密度的測定。結(jié)果顯示，日內(nèi)相對標準偏差（RSD，n=7）為1.2%～3.4%。表明該方法具有較好的日內(nèi)穩(wěn)定性。

2.5 方法的回收率和精密度結(jié)果

準確稱取1 g制備好的茶葉樣品于10 mL離心管中，分別添加如表3所示濃度水平的混合標準溶液，渦旋3 min，靜置30 min。每個添加水平設(shè)6次重復(fù)，按照“1.3.3”方法進行樣品前處理后進樣檢測。由表2可見，在3個添加濃度水平下，均滿足回收率和精密度要求。

3 小結(jié)與討論

本研究通過用超聲法提取茶樣中的洛伐他汀，優(yōu)化超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件，建立了用液質(zhì)法快速測定洛伐他汀含量的檢測方法，并對該方法進行了驗證。試驗結(jié)果表明，所建立的液-質(zhì)法簡單、靈敏、快速、準確，適用于普洱茶中保健物質(zhì)洛伐他汀含量的測定。

參考文獻：

[1] ENDO A.Monacolin K，a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species[J]. J Antibiot，1979，32（8）：852-854.

[2] ALBERTS A， CHEN J， KURON G， et a1. Mevinolin： a highly potent competitive inhibitor of hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase and a cholesterol-lowering agent[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1980，77（7）：3957-3961.

[3] ZLATKO P， DUSAN M，DAVID S. Process of the obtaining of HMG-CoA reductase inhibitors of high purity[P]. US：CA 2321052.

[4] HWANG L S，LIN L C，CHEN N T，et al.Hypolipidemic effect and antiatherogenic potential of Pu-Erh tea[J]. ACS Symposium Series，2003，859：87-103.

[5] YANG D J，HWANG L S. Study on the conversion of three natural statins from lactone forms to their corresponding hydroxy acid forms and their determination in Pu-Erh tea[J]. J Chromatography A，2006，1119（1-2）：277-284.

[6] 謝春生，謝知音.普洱茶中降血脂的有效成分他汀類化合物的新發(fā)現(xiàn)[J].河北醫(yī)學(xué)，2006，12（12）：1326-1327.

[7] 羅仁才，孫開奇，謝申猛，等.紅曲中洛伐他汀總量的測定方法[J].衛(wèi)生研究，2003，32（2）：157-158.

[8] 張樹丹，李海濤.以紅曲為原料保健食品中洛伐他汀的含量測定[J].中國當代醫(yī)藥，2012，19（29）：5-7.

[9] 趙振軍，童華榮，周 黎，等.普洱茶中真菌合成洛伐他汀的能力分析[J].食品科學(xué)，2012，33（12）：173-176.

[10] WANG D，WANG D M，QIN F， et al. Determination of lovastatin in human plasma by ultra-performance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Biomedical Chromatography，2008，22（5）：511-518.

[11] ELZBIETA K，EWA M，BARBARA K，et al.Development of chromatographic method for determination of drugs reducing cholesterol level[J].Acta Poloniae Pharmaceutica-Drug Research， 2012，69（1）：139-143.

[12] 吳曉剛，陳孝權(quán)，肖海軍，等.超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法檢測茶葉中8種殺蟲劑殘留[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2013，15（6）：655-660.