花生作圖親本間分子標(biāo)記的多態(tài)性分析

許夢(mèng)琦 李雙鈴 任艷 石延茂 王輝 尹亮 袁美 劉志文

摘要：利用AhMITE、SSR、SRAP及SRAP-RGA 4種分子標(biāo)記技術(shù)研究了花生（Arachis hypogaea Linn）作圖親本花育22號(hào)與“950527”間的分子多態(tài)性。經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，822對(duì)AhMITE引物、1 106對(duì)SSR引物、460對(duì)SRAP和731對(duì)SRAP-RGA引物在兩親本間表現(xiàn)穩(wěn)定多態(tài)性的數(shù)量分別為101、207、25和72對(duì)，多態(tài)性比率分別為12.3%、 18.7%， 5.4%和9.8%。結(jié)果表明，SSR標(biāo)記揭示作圖親本間多態(tài)性的效率最高，其次是AhMITE標(biāo)記，SRAP標(biāo)記的多態(tài)性和重復(fù)性最差。

關(guān)鍵詞：花生（Arachis hypogaea Linn）；多態(tài)性；分子標(biāo)記；SSR；AhMITE；SRAP；SRAP-RGA

中圖分類(lèi)號(hào)：S565.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）11-2763-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.054

Polymorphic Analysis of Molecular Markers between Mapping Parents in Peanut

XU Meng-qi1，2，LI Shuang-ling2，REN Yan2，SHI Yan-mao2，WANG Hui2，YIN Liang2，YUAN Mei2，LIU Zhi-wen1

（1. School of Biological Engineering， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， Liaoning， China； 2. Shandong Peanut Research Institute/Shandong Provincial Key Laboratory of Peanut/Key Laboratory of Peanut Biology and Genetic Improvement， Ministry of Agriculture， Qingdao 266100， Shandong， China）

Abstract： Polymorphism between two mapping parents Huayu 22 and “950527” in peanut（Arachis hypogaea Linn） was screened by using four types of molecular marker technology， including AhMITE，SSR，SRAP and SRAP-RGA. After primary and secondary screening with 822 pairs of AhMITE，1 106 pairs of SSR，460 pairs of SRAP and 731 pairs of SRAP-RGA primers， 101，207，25 and 72 pairs of primers were detected， respectively，showing stable polymorphism between the two parents， and the polymorphism ratios were 12.3%，18.7%，5.4% and 9.8%，separately. The results showed that， SSR markers are most efficient in revealing polymorphism between the mapping parents， followed by AhMITE markers， and SRAP markers are the worst in polymorphism and repeatability.

Key words： peanut（Arachis hypogaea Linn）； polymorphism； molecular markers； SSR； AhMITE； SRAP； SRAP-RGA

花生（Arachis hypogaea Linn）栽培種（2n=4x=40）起源于玻利維亞南部和阿根廷北部，是世界上重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物之一，也是許多發(fā)展中國(guó)家植物油和蛋白質(zhì)的重要來(lái)源[1]?；ㄉ某Ｒ?guī)育種方法存在育種周期長(zhǎng)、對(duì)目標(biāo)單株的選擇效率低、成本高等難以克服的缺點(diǎn)[2]。20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代作物遺傳育種研究的各個(gè)方面，并取得了豐碩成果[3-6]，許多過(guò)去無(wú)法進(jìn)行的研究在分子標(biāo)記的幫助下得以開(kāi)展，大大加快了花生育種工作的進(jìn)程[5，7]?；ㄉa(chǎn)量、油分含量和抗逆性均為復(fù)雜的數(shù)量性狀，從分子水平研究其遺傳基礎(chǔ)必將有助于改良這些性狀，從而育成高產(chǎn)、高油、多抗的花生新品種，而高質(zhì)量遺傳圖譜則是在分子水平上研究復(fù)雜性狀的基礎(chǔ)和保證[8-12]。

花生根結(jié)線蟲(chóng)病是中國(guó)大部分花生生產(chǎn)區(qū)經(jīng)常發(fā)生的一種具有毀滅性的病害。目前，花生根結(jié)線蟲(chóng)病波及面積越來(lái)越廣，病害趨勢(shì)也逐步加重，嚴(yán)重影響了花生的產(chǎn)量和品質(zhì)，大大降低了農(nóng)民的收入。而防治此種病害的農(nóng)藥如神農(nóng)丹、呋哺丹等都是高毒高殘留農(nóng)藥，不僅污染環(huán)境，而且對(duì)人類(lèi)的健康造成了不可估量的危害。農(nóng)藥的使用終歸治標(biāo)不治本，培育抗根結(jié)線蟲(chóng)病花生品種才是控制花生根結(jié)線蟲(chóng)病危害的最理想的途徑[13]，而分子遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建可為抗病基因的定位、克隆以及抗根結(jié)線蟲(chóng)病分子育種奠定基礎(chǔ)。本研究以農(nóng)藝性狀優(yōu)良但對(duì)花生根結(jié)線蟲(chóng)病表現(xiàn)感病的花生材料花育22號(hào)和表現(xiàn)高抗的“950527”為作圖親本，利用AhMITE、SSR、SRAP及SRAP-RGA 4種分子標(biāo)記技術(shù)研究了花育22號(hào)、“950527”、抗病混和池和感病混和池間的分子多態(tài)性，以期為花生高質(zhì)量遺傳圖譜的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用花生親本為農(nóng)藝性狀優(yōu)良但感病的材料花育22號(hào)和高抗材料“950527”，以花育22號(hào)為父本，“950527”為母本進(jìn)行雜交獲得F1代。第二年經(jīng)分子水平鑒定和田間表型鑒定，選擇真雜種F1代單株混收獲得F2代種子，編號(hào)為AA72。第三年種植F2代種子于山東省花生研究所線蟲(chóng)病圃，播種后35 d逐株進(jìn)行抗病性鑒定，鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[14]。鑒定后將感病和抗病植株各隨機(jī)選取30個(gè)單株并提取DNA。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 花生基因組DNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)量濃度后，將親本DNA稀釋到10 ng/μL待用。將挑選出的感病和抗病的F2單株DNA分別混合構(gòu)成感病混合池和抗病混合池DNA，使其終濃度均為10 ng/μL。

1.2.2 引物 所用SSR引物來(lái)自Zhao等[15]，AhMITE引物來(lái)自Shirasawa等[16，17]，SRAP和SRAP-RGA引物來(lái)自王潔[18]。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系和熱循環(huán)程序 PCR反應(yīng)體系為10 μL，含5 μL 2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]、0.3 μL正向和反向引物（10 μmol/L）、2 μL基因組DNA（10 ng/μL）、2.4 μL ddH2O。

各標(biāo)記PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋孩貯hMITE標(biāo)記。94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min； 4 ℃保存。②SSR標(biāo)記。94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。③SRAP標(biāo)記。94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)5次；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。④SRAP-RGA標(biāo)記： 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min， 45 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)5次；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.4 電泳檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析 AhMITE和SSR標(biāo)記使用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，180 V電壓電泳1 h；SRAP和SRAP-RGA標(biāo)記用6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，500 V電壓電泳2 h。電泳緩沖液均為0.5×TBE。電泳結(jié)束后，用0.1% AgNO3進(jìn)行染色，并拍照保存。

多態(tài)性比率為多態(tài)性標(biāo)記數(shù)占篩選標(biāo)記總數(shù)的百分比。

2 結(jié)果與分析

利用兩個(gè)親本DNA和兩個(gè)混合池DNA對(duì)822對(duì)AhMITE引物、1 106對(duì)SSR引物、460對(duì)SRAP引物組合和731對(duì)SRAP-RGA引物組合進(jìn)行了初次篩選。圖1為部分引物的篩選結(jié)果，如圖1中的箭頭所示，圖1A中的AhMITE0615，圖1B中的SSR-C5、C12、D6，圖1C中的M7fE22均在親本間表現(xiàn)多態(tài)性；圖1D中的R25RE05和R25RE09則在親本間和感抗池間均表現(xiàn)多態(tài)性。由表1可知，在所篩選的4種標(biāo)記中，兩親本間SSR標(biāo)記的多態(tài)性比率最高（39.0%），其次是AhMITE標(biāo)記（29.7%）和SRAP-RGA標(biāo)記（28.9%），SRAP標(biāo)記最低（23.3%）；感抗池間的多態(tài)性比率明顯低于感抗親本間，SSR標(biāo)記的多態(tài)性比率最高，其次是SRAP-RGA標(biāo)記和AhMITE標(biāo)記，SRAP標(biāo)記最低。從初篩結(jié)果可以看出，兩個(gè)作圖親本間表現(xiàn)多態(tài)性的分子標(biāo)記總數(shù)達(dá)到933，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到高密度分子遺傳圖譜構(gòu)建的要求。前人的研究表明，花生栽培種間遺傳基礎(chǔ)狹窄，因此基于PCR擴(kuò)增的第二代分子標(biāo)記的多態(tài)性水平比較低，可用于花生圖譜構(gòu)建的多態(tài)性分子標(biāo)記數(shù)量還十分有限[6，15]。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證初篩結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性，用初篩得到的多態(tài)性分子標(biāo)記對(duì)兩個(gè)親本和感抗池間DNA進(jìn)行第二輪和第三輪篩選。由于復(fù)篩后感病混合池和抗病混合池間多態(tài)性的重復(fù)性很低，因此統(tǒng)計(jì)多態(tài)性分子標(biāo)記時(shí)只統(tǒng)計(jì)感抗親本間多態(tài)性比率（表2）。與初篩結(jié)果相比，4種分子標(biāo)記的多態(tài)性標(biāo)記數(shù)量大大減少，AhMITE多態(tài)性標(biāo)記數(shù)由244減少到101，SSR多態(tài)性標(biāo)記數(shù)由431減少到207，SRAP多態(tài)性標(biāo)記數(shù)由107減少到25，SRAP-RGA多態(tài)性標(biāo)記數(shù)由211減少到72。從多態(tài)性比率來(lái)看，SSR標(biāo)記的多態(tài)性比率最高（18.7%），AhMITE標(biāo)記（12.3%）和SRAP-RGA標(biāo)記（9.8%）次之，SRAP標(biāo)記最低（5.4%）。經(jīng)3次篩選出的多態(tài)性分子標(biāo)記總數(shù)達(dá)到405，可用于F2代群體單株的基因分型，為下一步的花生栽培種分子遺傳圖譜的構(gòu)建和抗線蟲(chóng)基因定位奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

3.1 關(guān)于初篩與復(fù)篩的多態(tài)性標(biāo)記數(shù)量

本研究中，復(fù)篩得到的多態(tài)性標(biāo)記數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于初篩結(jié)果。造成此現(xiàn)象的原因可能是在初篩的擴(kuò)增過(guò)程中，由于模板或引物濃度過(guò)高、Taq酶量過(guò)多、引物特異性差、擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)過(guò)多及Mg2+濃度偏高等原因引起PCR擴(kuò)增中出現(xiàn)一些非特異擴(kuò)增。這些非特異擴(kuò)增導(dǎo)致初篩結(jié)果統(tǒng)計(jì)的多態(tài)性標(biāo)記數(shù)量偏高，但并不能穩(wěn)定保持，因此在復(fù)篩過(guò)程中并沒(méi)有出現(xiàn)。同時(shí)， 為了保證下一步的F2代群體單株基因分型的準(zhǔn)確性和重復(fù)性， 在復(fù)篩結(jié)果統(tǒng)計(jì)中只統(tǒng)計(jì)差異條帶強(qiáng)的標(biāo)記數(shù)。PCR擴(kuò)增中使用的天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的2×Taq PCR MasterMix包含Buffer，dNTPs和Taq酶，對(duì)低質(zhì)量和微量的DNA均具有極好的擴(kuò)增效果，其中Taq酶和Mg2+的濃度固定，在下一步的試驗(yàn)中可嘗試在不影響擴(kuò)增效果的前提下，優(yōu)化Mix的用量或降低PCR循環(huán)次數(shù)，以降低非特異擴(kuò)增出現(xiàn)的概率，并得到更清晰、穩(wěn)定的條帶。

3.2 4種分子標(biāo)記的比較

本研究中不同分子標(biāo)記的多態(tài)性比率差異較大。AhMITE標(biāo)記、SSR標(biāo)記、SRAP標(biāo)記及SRAP-RGA標(biāo)記的多態(tài)性比率分別為12.3%、18.7%、5.4%和9.8%，其中SSR標(biāo)記的多態(tài)性比率最高，其次是AhMITE標(biāo)記和SRAP-RGA標(biāo)記，而SRAP標(biāo)記的多態(tài)性比率最低。在擴(kuò)增的穩(wěn)定性和重復(fù)性方面，AhMITE和SSR標(biāo)記較好，SRAP-RGA標(biāo)記次之，SRAP標(biāo)記最差。綜合來(lái)看，SSR標(biāo)記在花育22號(hào)與“950527”這對(duì)作圖親本中的應(yīng)用效果最好，而SRAP標(biāo)記的多態(tài)性和重復(fù)性最差。

3.3 不同作圖親本間的多態(tài)性比較

本研究對(duì)作圖親本花育22號(hào)與“950527”進(jìn)行了822對(duì)AhMITE引物、1 106對(duì)SSR引物、460對(duì)SRAP引物組合和731對(duì)SRAP-RGA引物組合的初篩和復(fù)篩，其中表現(xiàn)穩(wěn)定多態(tài)性的標(biāo)記數(shù)量分別為101、207、25和72，多態(tài)性比率分別為12.3%、18.7%、5.4%和9.8%，整體的多態(tài)性比率為13.0%。山東省花生研究所細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室對(duì)花生的另一個(gè)作圖群體的親本花育22號(hào)與D99的多態(tài)性標(biāo)記的篩選結(jié)果為，在823對(duì)AhMITE引物、2 172對(duì)SSR引物、460對(duì)SRAP引物組合和507對(duì)SRAP-RGA引物組合中，篩選出了多態(tài)性穩(wěn)定的84對(duì)AhMITE引物、188對(duì)SSR引物、8對(duì)SRAP引物組合和8對(duì)SRAP-RGA引物組合，4種標(biāo)記的多態(tài)性比率分別為10.2%、8.7%、1.7%和1.6%，整體的多態(tài)性比率為7.3%。比較這兩對(duì)作圖親本的分子標(biāo)記多態(tài)性比率，本研究中花育22號(hào)與“950527”這對(duì)作圖親本的多態(tài)性比率整體略高。因此可以得出結(jié)論，花育22號(hào)與“950527”這對(duì)作圖親本的多態(tài)性比率在正常范圍內(nèi)。

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