王青松，柳永，王新，孫宏，姚曉紅，吳逸飛，湯江武＊，葛向陽＊

（1．華中農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢430070；2．浙江省農業(yè)科學院植物保護與微生物研究所，杭州310021）

基于質構量化分析的凈水菌膠囊制備及其性能研究

王青松1，柳永2，王新2，孫宏2，姚曉紅2，吳逸飛2，湯江武2＊，葛向陽1＊

（1．華中農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢430070；2．浙江省農業(yè)科學院植物保護與微生物研究所，杭州310021）

為提高凈水菌劑的應用性能，通過固定化包埋處理，以實心載菌膠囊為研究模型，以質構量化分析數(shù)據(jù)為主要篩選依據(jù)，通過不同輔料配方和制作工藝對膠囊的硬度、黏聚性和彈性恢復進行比較研究，以篩選出較佳的輔料配方和加工工藝，并對較佳配方的載菌膠囊進行斷面形貌觀察、孔隙率測定、菌劑釋放率測定和氨氮模擬污水凈化實驗．結果表明：較佳成囊壁材配方為V（4%海藻酸鈉）∶V（10%聚乙烯醇）＝1∶9，固化液配方為4% H3BO4和4%CaCl2混合溶液，輔料硅藻土、沸石粉和竹炭的適宜添加量分別為20%～30%、20%～80%和20%～60%；膠囊為多孔結構，單獨添加硅藻土、沸石粉、竹炭或三者混合添加下，膠囊微觀結構存在差異，其中硅藻土、沸石粉和竹炭經包埋后比表面積和孔容均減小，孔徑變化不大；24h內膠囊中菌劑的水體釋放率較低，為1%～14%；載菌膠囊在模擬污水凈化實驗中，20h后各實驗組氨氮質量濃度從1h時的39．3～44．7mg／L降低到0．1mg／L以下，其中未經包埋的菌株直接投放組降低最快，其次為混合1組［V（4%海藻酸鈉）∶V（10%聚乙烯醇）＝1∶9，海藻酸鈉和聚乙烯醇總體積10mL＋硅藻土1．5g＋沸石粉0．5g＋竹炭0．5g＋菌懸液2mL］和竹炭組，同時，總氮也出現(xiàn)不同程度的降低．總之，該研究采用的質構量化分析方法為凈水菌固定化載體研究提供了可靠的數(shù)據(jù)支撐，研究獲得的優(yōu)化膠囊體系在質構和凈水能力方面均表現(xiàn)出良好的性能，在環(huán)境污染水體微生物凈化治理方面具有較大的應用潛力．

載菌膠囊；質構量化分析；內部結構；混合比例；氨氮降解

Journal of Zhejiang University（Agric．＆Life Sci．），2015，41（6）：712－722

SummaryThe technology for microorganism immobilization originated from the immobilized enzyme technology in the 1970s．After decades of development，it has been widely used in food fermentation and environmental protection，etc．Especially，microbe－embedded capsules have drawn substantial attentions fromresearchers due to their significant roles in water purification and sewage treatment．However，lack of consolidated standards has impeded their applications．Texture profile analysis（TPA）has been widely used in food industry for determination of product structure and quality，while its application in non－food field is yet to be explored．Therefore，in the present study，TPA was used for the development and optimization of bacteria－embedded solid capsule systems in the purpose of water purification．

To achieve this purpose，solid capsules were prepared with different materials，such as diatomite，zeolite powder and bamboo charcoal in different blending ratios．TPA was employed to characterize these capsules in respects of hardness，cohesiveness and elastic resilience（springiness）．Meanwhile，scanning electron microscopy（SEM）was adopted to investigate the sectional structure and pore size of these capsules．Furthermore，simulative experiments in both ultrapure water and sewage were carried out to examine the releasing velocity and water purification efficiency of these bacteria－embedded solid capsules．Combining with TPA and SEM，the factors influencing the internal structure of capsules including embedding／crosslinking medium，curing duration，and ingredient proportions were explored，thus providing standards and guidelines for the preparation of bacteriaembedded capsules for large－scale practical applications in the future．

The TPA data showed that a high ratio of sodium alginate in the embedding medium resulted in capsules with high strength，and polyvinyl alcohol rendered cohesiveness and resilience（springiness）to capsules．An optimal embedding medium system was established as follows：V（4%sodium alginate）∶V（10%polyvinyl alcohol）＝1∶9for embedding medium，while the mixture of 4%boric acid and 4%calcium chloride for crosslinking medium．The optimal concentrations of various materials were determined as follows：20%－30%for diatomite，20%－80%for zeolite powder and 20%－60%for bamboo charcoal．The optimal curing duration varied from 16 to 36h．The SEM images indicated the existence of internal microspores both at nanoscale and micron－size in the crosslinked capsules，and differences on microstructures of capsules were observed among single or combining addition of diatomite，zeolite powder and bamboo charcoal．Both specific surface area and pore volume decreased after embedding，but not for pore size．The releasing rates of bacteria in capsules in 24hwere low，from 1%to 14%．In the simulative experiments of the sewage purification，all groups，including bacteria－embedded capsule and free bacteria，showed good ammonia removal efficiency．The final concentration of ammonia was below 0．1 mg／L after 20h，while the initial concentration was 39．3－44．7mg／L．The bacteria－free group had the highest ammonia removal efficiency，followed by mixture 1group（1mL of 4%sodium alginate，9mL of 10%polyvinyl alcohol，1．5g diatomite，0．5g zeolite powder，0．5g bamboo charcoal，and 2mL bacterial culture）and bamboo charcoal group．Meanwhile，the total nitrogen concentration decreased at a certain degree．These results confirmed that these capsules were applicable for sewage treatment．

In conclusion，the present study establishes successfully standards and guidelines for the preparation of bacteria－embedded capsules on the basis of TPA in combination with SEM and simulative experiments．This profound step can accelerate the practical application of bacteria－embedded capsules in actual sewage purification．

微生物在水體污染物降解中扮演著無可替代的重要角色，其對有機物的礦化轉化、對氮素的轉化和反硝化脫除以及對磷的聚集固化是實現(xiàn)污染水體凈化的重要的天然機制．2013年浙江省地表水省控斷面監(jiān)測顯示的主要污染物——氨氮、石油類和總磷［1］均涵蓋在微生物凈化能力范疇之內．如何激活或強化微生物對特定污染物的凈化能力，是開展污染水體生物治理研究的重要方向．

已有的污染水體微生物修復研究報道多見于環(huán)境處理微生物菌株的篩選和開發(fā)利用方面，多種微生物菌劑如球菌、假單孢菌、寡養(yǎng)假單孢菌、枯草芽孢桿菌等［2－6］已被應用于環(huán)境污水的治理中［7－8］．相比直投游離菌劑，固定化菌劑具有微生物密度高、便于培養(yǎng)優(yōu)勢菌群、加工穩(wěn)定性高、環(huán)境耐受力強、可定點釋放、發(fā)揮作用突出以及節(jié)約人力成本等優(yōu)點，因而獲得了越來越多的重視．已見報道的菌劑載體材料研究包括：陳慧英［9］制作了天然菌絲球載體，Lin等［10］以棉纖維為吸附載體用于石油污染處理，Liu等［2］以改性竹炭為固定化載體用于硝酸鹽的去除，Zhou等［11］以復合聚氨酯泡沫為固定化載體用于Cu2＋的去除，Bai等［12］制作了多孔交聯(lián)聚乙烯醇泡沫作為菌劑載體，Partovinia等［13］則采用凍融法制備了多孔聚乙烯醇菌劑載體材料，王興南［14］制備了多孔型懸浮載體材料，等．菌劑包埋方式由最初的簡單吸附發(fā)展為吸附、包埋、交聯(lián)、截留等多種形式［15］．此外，也有一系列用于環(huán)境治理的高效生物反應器見于報道，如Zhao等［16］開發(fā)的曝氣生物濾池（biological aerated filter，BAF），Xiao等［6］研發(fā)的AYC生物反應系統(tǒng)和Tong等［17］開發(fā)的固定化生物濾器，等．而上述凈水菌劑負載體系對材料性能的評估主要采用硬度測定以及感官評定的方式進行，量化數(shù)據(jù)指標較少，質構性能表征不全面．質構分析（texture profile analysis，TPA）儀是一種感官量化測定儀器，主要用于對食品物性特點做出數(shù)據(jù)化的準確表述，能夠從硬度、黏聚性以及彈性恢復3個方面對物體進行質構量化分析．完善的硬度、黏聚性和彈性恢復測試數(shù)據(jù)，為載菌輔料配方的篩選和制作工藝的優(yōu)化提供了更科學可靠的量化依據(jù)，有利于高性能菌劑載體的獲得．本文基于質構量化分析開展了凈水菌劑的固定化包埋研究，獲得了較佳的輔料配方和制作工藝，并在此基礎上，對載菌膠囊進行了形貌觀察、孔隙率測定以及模擬氨氮污水凈化實驗．

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗菌株 W13菌株和蠟樣芽孢桿菌，由浙江省農業(yè)科學院酶與發(fā)酵工程實驗室從環(huán)境污水中篩選獲得，具有高效降解氨氮和總氮的生理活性．

1．1．2 主要實驗藥品 海藻酸鈉、聚乙烯醇（聚合度1 750±50）和檸檬酸鈉均購自國藥集團化學試劑有限公司；CaCl2購自Bio Basic公司（德國）；H3BO4購自杭州市高晶精細化工有限公司；竹炭（80目）購自四川省成都市郫縣神火木炭有限公司，硅藻土（200目）購于浙江省嵊州市華力硅藻土制品有限公司，沸石粉（50目）購自鄭州市凱嵐水處理材料有限公司（這3種輔料使用前均經過高壓滅菌處理）；胰蛋白胨和酵母提取物均購自英國Oxoid公司；其他化學試劑均為國產分析純．氨氮模擬污水配方（1L）：NH4Cl 0．191g、檸檬酸鈉2．94g、MgSO4· 7H2O 0．2g、NaCl 0．5g、K2HPO45．0g、KH2PO41．5g、微量元素液1mL、ddH2O 999mL，121℃高壓滅菌30min，冷卻后待用．其中，微量元素液配方（1L）：乙二胺四乙酸50g、CaCl25．5g、ZnSO42．2 g、MnCl2·4H2O 5．06g、FeSO4·7H2O 5．0g、（NH4）6Mo7O24·H2O 1．1g、CuSO4·5H2O 1．57 g、CoCl2·6H2O 1．61g、ddH2O 1 000mL，調節(jié)pH至7．0．

1．1．3 主要實驗儀器 物性質構儀（TA－XTPlus，英國SMSTA公司）；物理吸附儀（ASAP 2010C，美國Micromeritics公司）；掃描電子顯微鏡（S－4700，日本Hitachi公司）；離心機（Sigma 3K18，德國Sigma公司）；高壓滅菌鍋（GI54D，美國Zealway公司）．

1．2 方法

1．2．1 膠囊體系的建立和優(yōu)化實驗

1．2．1．1 成囊壁材成分和固化液配方篩選．成囊壁材配方溶液：配制質量分數(shù)為4%的海藻酸鈉水溶液（于60℃水浴溶解）和質量分數(shù)為10%的聚乙烯醇水溶液（現(xiàn)制現(xiàn)用），將海藻酸鈉和聚乙烯醇溶液按照一定體積比混合獲得5種成囊壁材溶液（A～E），即V（海藻酸鈉）∶V（聚乙烯醇）＝9∶1，5∶1，1∶1，1∶5和1∶9．固化液配制：將H3BO4和CaCl2按一定質量分數(shù)和比例溶解于ddH2O水中，獲得3組交聯(lián)劑配方溶液，即1＃：1%H3BO4和4%CaCl2混合溶液，2＃：4%H3BO4和4%CaCl2混合溶液，3＃：4%H3BO4和1%CaCl2混合溶液，滅菌備用．

將A～E 5種成囊壁材溶液混合均勻后，使用一次性5－mL注射器（去針頭）分別滴入到1＃、2＃和3＃固化液中，通過體系中海藻酸鈉與Ca2＋、聚乙烯醇與H3BO4分別交聯(lián)固化過夜制成膠囊，使用ddH2O沖洗膠囊后于超凈臺瀝干并保存于4℃?zhèn)溆茫∩鲜龈鹘M膠囊進行質構性能測試，以質構數(shù)據(jù)為標準篩選出較佳的成囊壁材配方和固化液配方．質構性能測試的主要參數(shù)如下：測前、測中和測后速度均為1．00mm／s，目標模式為距離模式，距離2 mm，保持時間5s，觸發(fā)模式為自發(fā)模式，觸發(fā)力0．049 03N，探頭為SWS P／2，S＝3．14mm2．從每組樣品中挑選粒徑較均勻（直徑約4～5mm）的5～6粒進行測定．

1．2．1．2 固化液對負載微生物的毒性實驗．各取1 mL在LB（Luria－Bertani）培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜的W13菌液，分別與90mL無菌ddH2O、2＃和3＃固化液混合均勻（根據(jù)前期實驗結果不再對1＃固化液進行后續(xù)實驗），于室溫下靜置并分別于30min、1h、2h、4h、8h、16h、24h取樣，采用平板涂布計數(shù)法進行W13活菌計數(shù)．通過觀察比較W13活菌數(shù)在固化液接觸條件下是否降低來判斷固化液對該菌株是否存在細胞毒性．

1．2．1．3 多孔輔料對膠囊質構性能改善效果實驗．以成囊壁材溶液E為基礎配方，按照每10mL成囊壁材溶液分別添加1．0、2．0、4．0、6．0和8．0g硅藻土、沸石粉或竹炭的比例添加輔料，各體系混合均勻后使用一次性5－mL注射器（去針頭）滴注到2＃固化液中，固化過夜獲得附加多孔輔料的膠囊，使用ddH2O沖洗膠囊后于超凈臺瀝去多余水分并進行質構性能測試，以確定最適的輔料添加量．

1．2．1．4 最適固化時長篩選實驗．根據(jù)確定出的最適輔料添加量，以成囊壁材溶液E為基礎配方，分別添加硅藻土2．0g、沸石粉2．0g或竹炭3．0g，各體系混合均勻后使用一次性5－mL注射器（去針頭）滴注到2＃固化液中，分別于1、2、4、8、16、24和36h取樣得到不同固化時長的膠囊，使用ddH2O沖洗膠囊后于超凈臺瀝去多余水分并進行質構測定（方法同1．2．1．1節(jié)），以確定最適的固化時長．

1．2．2 載菌膠囊的孔隙率測定及微觀和宏觀形貌觀察 進行孔隙率測定的微膠囊以成囊壁材溶液E為基礎配方，在10mL包埋壁材體系中輔料總添加量均為2．5g．其中，混合1組：m（硅藻土）∶m（沸石粉）∶m（竹炭）＝3∶1∶1，混合2組：m（硅藻土）∶m（沸石粉）∶m（竹炭）＝2∶1∶2，及3種輔料單一添加實驗組，共5個實驗組，將其混合均勻后使用一次性5－mL注射器滴入2＃固化液中固化約16h，制得微膠囊．

1．2．2．1 載菌膠囊孔隙率測定．取輔料硅藻土、沸石粉、竹炭原料以及1．2．2節(jié)中制備的5組膠囊各2．0g，于烘箱中50℃烘干過夜作為待測樣品，根據(jù)氮吸附法對樣品進行測定，即取一定量（＞1g）樣品先進行脫氣處理（160℃，12h），隨后在液氮溫度下進行氮氣的吸脫附．根據(jù)Brunauer－Emmet－Teller（BET）方程和Barrett－Joyner－Halenda（BJH）模型分別計算出樣品的比表面積和孔徑分布等數(shù)據(jù)．

1．2．2．2 載菌膠囊掃描電子顯微鏡觀察．取1．2．2節(jié)中制備的膠囊硅藻土組、沸石組、竹炭組，每組各3粒，將膠囊封閉在濾紙中，使用乙醇進行梯度脫水干燥：分別將膠囊依次置于30%乙醇，室溫30min；50%乙醇，室溫30min；70%乙醇，室溫30min；80%乙醇，室溫30min；90%乙醇，室溫30min； 100%乙醇，室溫30min，共2次．隨后將膠囊浸于乙酸正戊酯中，15min／次，共2次．最后將膠囊置于干燥通風處自然干燥．待樣品干燥、制樣噴金后進行掃描電子顯微鏡觀察．

1．2．2．3 凈水實驗的膠囊照片．取1．2．2節(jié)中所制的5組膠囊分別置于平板中，使用直尺作為實物比例尺，使用Nikon D5300相機進行照片拍攝，觀察．1．2．3 膠囊的實驗室模擬凈水實驗和釋放實驗

進行凈水實驗的膠囊實驗組配方見1．2．2節(jié)，與其不同的是在各實驗組中均加入已知濃度的菌懸液2 mL，并計算出各實驗組膠囊的菌含量．在進行模擬凈水實驗時根據(jù)膠囊的菌含量對投菌量進行統(tǒng)一．間隔一定時間取水樣測定水體中的氨氮和總氮含量．水質氨氮采用水楊酸分光光度法測定，參照HJ 536—2009進行［18］；水質總氮采用堿性過硫酸鉀消解－紫外分光光度法測定，參照HJ 636—2012進行［19］．

分別取一定量上述膠囊投于經高壓滅菌的超純水和模擬污水中進行釋放實驗，每個實驗組總投菌量控制在1．0×107CFU／mL左右，間隔一定時間后取水樣于超凈臺上進行稀釋涂布平板計數(shù)，確定水溶液中微生物的數(shù)量．通過對比水體中W13的活菌數(shù)判定膠囊中所包埋的微生物是否釋放出以及在模擬污水中是否進行了增殖．

膠囊的菌含量計算方法：先稱量空的平板和注射器（去針頭）質量，記為m1（每組實驗獨立使用平板和注射器，不混用）．將聚乙烯醇和海藻酸鈉加入平板，再將菌懸液依量加入，混勻，最后將輔料加入，體系混勻，稱平板＋注射器（去針頭）＋輔料＋菌懸液質量，記為m2．然后進行膠囊滴注，將混合均勻的膠囊體系吸入注射器，再將混合體系逐滴滴入裝有4%飽和H3BO4溶液和4%CaCl2的燒杯中，交聯(lián)固化過夜，稱量殘留有菌懸液及材料的平板和注射器，記為m3．將交聯(lián)固化過夜的微生物膠囊用ddH2O沖洗3遍，瀝去多余的水分，置于烘箱40℃稍微烘干，稱量最終所得的膠囊質量，記為m4．（m2－m3）／（m2－m1）即為制得膠囊中所含菌懸液的比例，已知菌懸液添加量和最終膠囊的質量m4便可粗略計算出膠囊中的菌含量．

2 結果與分析

2．1 膠囊體系的建立和優(yōu)化實驗結果

2．1．1 不同混合比例的壁材在不同固化液中制備的膠囊質構測定結果 由表1可知，A、B、C、D和E 5種配方壁材形成的膠囊硬度呈現(xiàn)出A＞B＞C＞D＞E的變化趨勢，且這一硬度變化趨勢在1＃、2＃和3＃固化液中均同步出現(xiàn)．由于從A到E配方是海藻酸鈉濃度逐步降低而聚乙烯醇濃度逐步升高的變化過程，說明膠囊硬度與海藻酸鈉濃度呈正相關，即較高海藻酸鈉濃度對獲得高硬度膠囊有利，反之則有利于低硬度膠囊的獲得．對各組別黏聚系數(shù)和彈性（恢復系數(shù)）的比較（表1）發(fā)現(xiàn)，聚乙烯醇濃度較高的D和E配方中膠囊的黏聚系數(shù)和彈性（恢復系數(shù)）普遍高于A、B和C等聚乙烯醇濃度較低的配方（1＃中除外，這可能是由于1＃中H3BO4濃度過低，膠囊壁材體系不能形成有效交聯(lián)），即較高的聚乙烯醇濃度有利于高黏聚系數(shù)和彈性恢復系數(shù)膠囊的獲得．對固化液成分與膠囊質構性能相關性分析發(fā)現(xiàn)，較高的CaCl2濃度有利于海藻酸鈉形成較高硬度的固化物，如海藻酸鈉濃度最高的A配方壁材，在CaCl2質量分數(shù)為4%的1＃和2＃固化液中形成的膠囊硬度［1＃－A：（3 357．10±355．64）μN和2＃－A：（2 313．49±107．51）μN］顯著高于其在CaCl2質量分數(shù)為1%的3＃固化液中所形成的膠囊硬度［3＃－A：（1 771．74±205．41）μN］．此外，在CaCl2質量分數(shù)同為4%時，H3BO3質量分數(shù)為4%的2＃固化液較H3BO3質量分數(shù)為1%的1＃固化液在A和B壁材配方下所形成的膠囊硬度均顯著降低，這表明H3BO3對海藻酸鈉固化結構的形成存在較大干擾．比較不同質量分數(shù)CaCl2的2＃和3＃固化液中膠囊的黏聚系數(shù)和彈性（恢復系數(shù)）發(fā)現(xiàn)，CaCl2對聚乙烯醇的固化結構形成無顯著性干擾．

表1 不同包埋體系和固化液組合實驗中各組膠囊質構數(shù)據(jù)Table 1 Textural data of capsules prepared with different embedding materials in different curing liquids

2．1．2 固化液對W13菌株的毒性測試結果 由圖1可知：2＃和3＃固化液對實驗菌株W13均存在一定的毒性作用，其中，3＃固化液的毒性弱于2＃；用2種固化液處理24h后，W13的存活率均在80%以上．說明2＃和3＃固化液均可用于包埋W13膠囊的制備，本實驗中以2＃為佳．以后的實驗可根據(jù)包埋菌劑的不同選擇不同的固化液濃度．

2．1．3 不同材料組合的膠囊質構測定結果 表2顯示：在包埋壁材體積為10mL時添加硅藻土、沸石粉和竹炭后膠囊硬度均增高，當添加量均為4g時，用這3種輔料制備的膠囊硬度與2．1．1節(jié)中2＃－E組相比，增幅分別為296．25、487．16和22 342．04μN，其中竹炭對膠囊硬度的增強效果最顯著；當添加量為1～6g時，膠囊硬度的升高與添加量的升高呈正相關，而黏聚性、彈性恢復與添加量呈負相關；當竹炭用量進一步增加到8g時，膠囊硬度出現(xiàn)回落，黏聚性和彈性恢復則進一步降低．這表明適宜的添加量有利于較佳膠囊硬度、黏聚性和彈性恢復的獲得．此外，由于以竹炭作為凈水菌劑載體對體對提高凈水性能有一定的增強效應［2］，本實驗采用較高的竹炭添加水平．綜上，當包埋壁材體積為10 mL時，硅藻土添加量在2．0～3．0g、沸石粉添加量在2．0～8．0g、竹炭添加量在2．0～6．0g時，膠囊在各方面的性能均表現(xiàn)良好．

圖1 固化液對W13菌株數(shù)量的影響Fig．1 Effects of curing liquid on quantity of strain W13

表2 不同材料組合膠囊的質構數(shù)據(jù)Table 2 Textural data of microcapsules with different material combinations

2．1．4 在不同固化時長下膠囊質構測定結果

從表3可以看出：當添加物為硅藻土時，在固化8～36h期間，膠囊硬度逐漸增加，尤其在固化24h和36h時，膠囊硬度增加最為顯著，固化36h時的膠囊硬度較固化1h時提高了120．5%，表明硅藻土膠囊的理想固化時間較長，以16～36h為宜；當添加物為沸石粉時，膠囊的質構參數(shù)未隨固化時長出現(xiàn)規(guī)律性變化，固化36h時的膠囊硬度較固化1h僅提高了27．9%，表明處理1h以上即可良好固化沸石組膠囊；當添加物為竹炭時，在固化1～8h期間，膠囊硬度逐步升高，在8h時達到最高值（21 540．89± 562．13）μN，在固化時長延長到36h的過程中，膠囊硬度發(fā)生回落，幅度為14．9%～25．0%，最低硬度為（16 157．65±1 544．68）μN．綜合分析認為，在混合添加硅藻土、沸石粉和竹炭情況下膠囊固化時長以16～36h為宜，膠囊各項質構參數(shù)均可保持在較高水平．

表3 在不同固化時長下膠囊的質構數(shù)據(jù)Table 3 Textural data of microcapsules under different curing time

2．2 膠囊孔隙測定及微觀和宏觀形貌觀察結果

2．2．1 膠囊孔隙測定結果 由表4可知：在3組材料中以竹炭的比表面積最大，沸石組的平均孔徑最大，在膠囊的內部存在很多的小孔，尺寸大小在納米級別．對單一輔料膠囊實驗組與原材料孔隙測定結果比較可知：各組膠囊的比表面積均有所下降，如硅藻土原材料組比表面積為4．954 9 m2／g，而硅藻土組膠囊比表面積為3．516 0m2／g；孔容也均出現(xiàn)下降，如竹炭原材料組孔容為0．116 7cm3／g，而竹炭組膠囊孔容為0．052 7 cm3／g．這說明有部分成囊壁材和微生物被固定于輔料的孔隙中．

表4 膠囊及原材料的孔隙測定結果Table 4 Porosity determination result of microcapsules and raw materials

圖2 不同材料組膠囊的掃描電鏡圖Fig．2 Scanning electron micrograph for microcapsules of different materials

2．2．2 膠囊的掃描電子顯微鏡觀察結果 由圖2可知：實驗所制的膠囊內部存在大量微米級和納米級空隙，相比硅藻土、竹炭或混合添加組，沸石組膠囊內部孔隙較小、交聯(lián)更為密集；在各組膠囊中，菌體細胞被膠囊內部網狀結構攔截而留存于膠囊孔隙中（如圖2中箭頭所示）．膠囊表層的菌體可能會脫落進入外界水體并流失，膠囊內部菌體則被截留于膠囊內部，能夠定點凈化水體．

2．2．3 膠囊宏觀形貌觀察結果 圖3所示為進行凈水實驗的5組膠囊．各組膠囊顆粒直徑均為4～5mm，硅藻土組為白色膠囊顆粒，竹炭組為黑色膠囊顆粒，沸石組為土黃色膠囊顆粒，混合組為深淺不同的黑色膠囊顆粒．

圖3 進行凈水實驗的膠囊形態(tài)Fig．3 Microcapsule form applied in the experiment of water purification

2．3 膠囊中包埋微生物的釋放實驗和實驗室模擬凈水實驗結果

2．3．1 膠囊在超純水及模擬污水中的釋放統(tǒng)計

從圖4A可以看出，膠囊中的微生物在釋放到模擬污水環(huán)境后進行了增殖，微生物數(shù)量在8h后迅速提高，在16h左右達到了107數(shù)量級，菌體總量超過投加量．從圖4B可以看出：在超純水中，24h內W13菌數(shù)始終保持在較低水平，尤其是沸石組（ZP）菌數(shù)最低，相比之下其他各組釋放量略高于沸石組，這與在圖2中觀測到的ZP組的致密孔隙結構特點相吻合；各組菌體釋放率為1%～14%．

2．3．2 在凈水實驗中氨氮降解和總氮去除結果

由圖5A可知：在模擬污水降解實驗中，各膠囊實驗組均能降低模擬污水中的氨氮值；在處理16h時，各處理組氨氮降解速度為直投（CK）＞混合1組（M1）＞竹炭組（BC）＞混合2組（M2）＝沸石組（ZP）＞硅藻土組（DE）；經處理20h時，各組模擬污水中氨氮值均降低到0．1mg／L以下，降解率達到99．7%以上．同時，24h后各實驗組模擬污水中的總氮值均有不同程度的下降，其中，直投組總氮值下降最多，膠囊組中以沸石組和混合1組的總氮值降低較多（圖5B）．

3 討論

圖4 載菌膠囊在人工模擬污水（A）和純水（B）中對W13菌的釋放Fig．4 Cumulative release of strain W13from microcapsules in artificially simulative sewage（A）and ultrapure water（B）

固定化成囊壁材的性能是影響固定化菌劑應用效果的關鍵因素之一，凈水菌劑成囊壁材的強度、透水性、黏聚性和彈性等性能對菌劑載體形貌和結構的保持，以及凈水應用性能的發(fā)揮具有重要意義．本文基于質構量化分析開展了凈水菌劑固定化體系的研究，并獲得了凈水性能較佳的載菌膠囊配方．高濃度聚乙烯醇、低濃度海藻酸鈉壁材配方和竹炭輔料在載菌膠囊穩(wěn)定性和硬度提高上貢獻最大．首先通過海藻酸鈉和聚乙烯醇的交聯(lián)固化，形成膠囊載體的基礎多孔結構．在海藻酸鈉上α－L－古羅糖醛酸與鈣離子的交聯(lián)為可逆反應，在環(huán)境應用中比較容易導致載體結構崩潰，但α－L－古羅糖醛酸和CaCl2的交聯(lián)反應迅速（約100s），這對成囊壁材成型有利，且易形成硬度較高的凝膠［20］．聚乙烯醇與H3BO4反應形成牢固的化學鍵［21］，其反應速度較慢但在水環(huán)境中穩(wěn)定性好．基于容易成型和高環(huán)境穩(wěn)定性的要求，該研究最終采用高濃度聚乙烯醇－低濃度海藻酸鈉配方制備載菌膠囊壁材．對高濃度聚乙烯醇壁材配方的選擇，進一步決定了適宜的固化液配方為高H3BO4含量的固化液配方．其次，通過多孔輔料的添加進一步改善膠囊載體的質構性能，尤其在添加竹炭后膠囊硬度增加幅度超過了40倍，遠高于同為輕質多孔結構的硅藻土．其原因可能與竹炭上攜帶較多-OH 和O基團有關［22］，竹炭上的OH可能參與了聚乙烯醇與H3BO4間的配位聚合反應，使得聚乙烯醇鏈得以固定于竹炭顆粒表面從而獲得支撐力，并最終表現(xiàn)為膠囊硬度大幅增高．

圖5 在凈水實驗中氨氮（A）和總氮（B）變化Fig．5 Change of ammonia nitrogen（A）and total nitrogen concentrations（B）in the experiment of water purification

膠囊的凈水效果主要由菌劑的活性決定，菌劑活性的發(fā)揮又與菌劑的存活狀態(tài)密切相關．在實驗室模擬污水中，游離的W13菌劑對氨氮和總氮的去除能力均高于其膠囊化包埋固定菌劑，究其原因與包埋處理后膠囊結構對菌劑與被降解物之間接觸造成的阻礙有關．對凈水菌劑固定化包埋的目的是提高其對流動水體的定點凈化治理能力，在能夠保證良好定點治理的基礎上，盡可能高的保持其對污染物的降解活性是凈水菌劑固定化的主要研究目的．根據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算，竹炭組膠囊在16h時對氨氮的去除率為直投菌劑的60．7%，混合1組膠囊的79．7%．在該研究中，竹炭組和混合1組載菌膠囊在實現(xiàn)菌劑良好固定化的同時，其凈水性能也獲得了較高程度的保持．

4 結論

該研究基于質構量化分析進行了膠囊壁材、輔料、固化劑和固化時間等因子的優(yōu)化篩選工作，通過質構數(shù)據(jù)的量化分析獲得了較佳的凈水菌劑載菌膠囊制備工藝，并開展了凈水性能驗證工作．結果表明，基于質構量化分析獲得的菌劑固定化包埋體系在膠囊機械性能和凈水性能上均有良好表現(xiàn)．較佳的載菌膠囊體系為4%海藻酸鈉1mL，10%聚乙烯醇9mL，竹炭2．5g或硅藻土、沸石粉和竹炭混合物2．5g（硅藻土1．5g＋沸石粉0．5g＋竹炭0．5 g），菌懸液2mL，混合均勻后于固化液（4%H3BO4和4%CaCl2混合溶液）中固定16～36h即可．在實際生產應用中可根據(jù)需要制備成球狀、片狀或條狀載菌形式．該研究中良好載菌體系的獲得與基于質構量化分析的膠囊制備工藝優(yōu)化方法密不可分．建立質構量化分析方法在凈水菌劑載體研究中的拓展應用將對菌劑載體性能量化評價和綜合性能的標準化評價發(fā)揮積極的作用．

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Wang Qingsong1，Liu Yong2，Wang Xin2，Sun Hong2，Yao Xiaohong2，Wu Yifei2，Tang Jiangwu2＊，Ge Xiangyang1＊
（1．State Key Laboratory of Agricultural Microbiology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；2．Institute of Plant Protection and Microbiology，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China）

bacteria－embedded capsules；texture profile analysis；internal structure；blending ratio；ammonianitrogen degradation

Q 814．2；X 172

A

10．3785／j．issn．1008－9209．2015．01．291

浙江省國際合作項目“微納米材料增效凈水活菌膠囊劑研制及應用＂（2012C24021）．

＊通信作者（Corresponding authors）：湯江武（http：／／orcid．org／0000－0003－0562－8983），Tel：＋86－571－86404323，E－mail：tangjiangwu＠sina．com；葛向陽（http：／／orcid．org／0000－0002－8941－1230），Tel：＋86－27－87281040，E－mail：gxy＠m(xù)ail．hzau．edu．cn

聯(lián)系方式：王青松（http：／／orcid．org／0000－0001－9599－6186），E－mail：weixiaochunfeng＠163．com

2015－01－29；接受日期（Accepted）：2015－04－21；< class="emphasis_bold">網絡出版日期

日期（Published online）：2015－09－30

URL：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／33．1247．S．20150930．1651．002．html