田蕾，李云芳，金朝霞，張良，張宗申，＊，郭啟根，于振艷

（1.大連工業(yè)大學(xué) 遼寧省發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116034；2.河南省健康偉業(yè)生物醫(yī)藥研究股份有限公司，河南 鄭州450001）

三七（Panaxnotoginseng）為五加科人參屬植物，享有“金不換”“南國(guó)神草”“人參之王”等美譽(yù)[1－2].其根莖和肉質(zhì)根為名貴的中藥，具有止血、散淤、消炎、止痛、滋補(bǔ)等功效，花有清熱的作用[3].三七主要產(chǎn)于云南文山和廣西等地，已有四百多年的栽培歷史，是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材[4].由于三七生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、易染病、管理技術(shù)復(fù)雜等因素，再加上有性繁殖會(huì)直接導(dǎo)致產(chǎn)量下降和品質(zhì)退化，近年來(lái)人們嘗試用組織培養(yǎng)技術(shù)等無(wú)性繁殖手段，改變?nèi)邆鹘y(tǒng)的有性繁殖生產(chǎn)途徑，希望擴(kuò)大獲得原藥或其有效成分的來(lái)源[5].

與傳統(tǒng)的栽培相比，利用組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)三七的替代品可以不受土地、環(huán)境、氣候等因素的影響.目前，關(guān)于三七組織培養(yǎng)技術(shù)的研究很少，本文對(duì)三七愈傷組織培養(yǎng)中的激素因素進(jìn)行深入研究，旨在為三七大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

以大連工業(yè)大學(xué)珍稀瀕危藥用植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室用云南文山三七種子制備的無(wú)菌苗為外植體，誘導(dǎo)出愈傷組織、繼代培養(yǎng).

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方法

挑選質(zhì)地均一、生長(zhǎng)良好的三七愈傷組織，分別在單獨(dú)添加2，4－D、6－BA或 KT的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，研究單一因素的濃度變化對(duì)三七愈傷組織生長(zhǎng)的影響[6].在上述三組試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)的方法，設(shè)計(jì)2，4－D、KT 和6－BA 三種激素組合，以不同濃度配比添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，探究三種激素共同作用于三七愈傷組織的效果.因素和水平見(jiàn)表1.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加30g/L蔗糖和5 g/L瓊脂粉.將1g鮮重的愈傷組織接種在裝有50 g固體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在25±1℃條件下暗培養(yǎng)30d，然后收獲、稱(chēng)重和計(jì)算.

1.2.2 愈傷組織增殖率的計(jì)算方法

鮮重:本文所述鮮重為10個(gè)培養(yǎng)瓶中三七愈傷組織鮮重（g）的平均值.

干重:本文所述干重為愈傷組織在70℃下烘干至恒重的重量.

ΔW＝W2－W1；

P＝ （ΔW/W1）×100%；

ΔW:愈傷組織生長(zhǎng)量（g）；

W1:愈傷組織接種量（g）；

W2:愈傷組織收獲量（g）；

P:愈傷組織增殖速率（%）.

2 結(jié)果與討論

2.1 2，4－D對(duì)三七愈傷組織增殖的影響

由圖1可以看出，三七愈傷組織在不同濃度的2，4－D培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，并且生長(zhǎng)效果較為顯著.其中增殖速率最大的為添加1.0mg/L 2，4－D的培養(yǎng)基中的三七愈傷組織，其平均鮮重達(dá)到4.537g，干重達(dá)到0.298g，為乳白色、質(zhì)地疏松，具有易分離和易分化的特征.隨著2，4－D濃度的增加，三七愈傷組織的鮮重呈逐漸下降的趨勢(shì)，但當(dāng)2，4－D濃度為2.0mg/L時(shí)，出現(xiàn)小幅度的上升趨勢(shì).上述結(jié)果表明，2，4－D作為組織培養(yǎng)的常用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能夠促進(jìn)三七愈傷組織的快速增殖.

2.2 6－BA 與2，4－D配比對(duì)三七愈傷組織增殖的影響

由圖2可以看出，三七愈傷組織在 MS＋2，4－D 1.0mg/L＋6－BA（0.5mg/L、1.0mg/L、1.5 mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L）的培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)量均有增加，其中愈傷組織增殖速度最快的為MS＋2，4－D 1.0mg/L＋6－BA 0.5mg/L，其鮮重達(dá)到5.034g，干重達(dá)到0.329g，明顯高于未添加6－BA的培養(yǎng)基中的愈傷組織.隨著6－BA濃度的升高，愈傷組織的鮮重及干重呈逐漸下降的趨勢(shì)，當(dāng)其濃度高于1.0mg/L時(shí)，愈傷組織鮮重逐漸小于未添加6－BA培養(yǎng)基中的愈傷組織.由此可見(jiàn)，當(dāng)6－BA與2，4－D共同作用于三七愈傷組織時(shí)，在一定程度上能夠促進(jìn)三七愈傷組織的快速增殖，但是其濃度配比是關(guān)鍵，如果6－BA濃度太高反而會(huì)抑制三七愈傷組織的生長(zhǎng).

圖1 2，4－D濃度對(duì)三七愈傷組織增殖的影響

圖2 6－BA與2，4－D配比對(duì)三七愈傷組織增殖的影響

2.3 KT對(duì)三七愈傷組織增殖的影響

將三七愈傷組織接種于 MS＋2，4－D 1.0mg/L＋6－BA 0.5mg/L＋KT（0mg/L、0.5mg/L、1.0 mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L）的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d后，三七愈傷組織生長(zhǎng)狀況出現(xiàn)明顯差異.當(dāng)激素配比為2，4－D 1.0mg/L＋6－BA 0.5 mg/L＋KT時(shí)，KT濃度增大，愈傷組織的鮮重也增加.但是由圖3可以看出，與未添加KT的愈傷組織（見(jiàn)圖3－1）相比，隨著KT濃度的增大（見(jiàn)圖3－2、圖3－3、圖3－4、圖3－5、圖3－6），三七愈傷組織顏色逐漸加深，由嫩黃色變?yōu)榘迭S色，表現(xiàn)出褐化趨勢(shì).

圖3 KT濃度對(duì)三七愈傷組織增殖的影響

2.4 2，4－D、6－BA 和KT對(duì)三七愈傷組織增殖的影響

采用正交設(shè)計(jì)方法，進(jìn)行16個(gè)組合試驗(yàn)，每組3個(gè)平行.在培養(yǎng)基中加入2，4－D、6－BA 和 KT三種激素的不同組合，以三七愈傷組織的增殖率為指標(biāo)進(jìn)行極差分析和方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2、表3、表4.極差分析的結(jié)果（見(jiàn)表3）表明，各因素對(duì)三七愈傷組織增殖速率影響的順序?yàn)?，4－D＞6－BA＞KT，其中最優(yōu)組合為 A2B1C3，即2，4－D 1.0mg/L＋6－BA 0.2mg/L＋KT 0.3mg/L.雖然通過(guò)極差分析，已經(jīng)得到了各因素影響的主次順序及最優(yōu)組合，但為了能夠進(jìn)一步地了解三種激素對(duì)三七愈傷組織增殖速率影響的顯著性，又對(duì)結(jié)果進(jìn)行了方差分析.由方差分析結(jié)果（見(jiàn)表4）可知，2，4－D對(duì)三七愈傷組織增殖誘導(dǎo)作用非常顯著，6－BA影響顯著，KT影響不顯著，但也不能將其忽略為誤差.

綜合極差分析和方差分析的結(jié)果，以三七愈傷組織增殖速率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)時(shí)，得出的最佳激素組合為2，4－D 1.0mg/L＋6－BA 0.2mg/L＋KT 0.3mg/L，該培養(yǎng)基中的三七愈傷組織生長(zhǎng)快、質(zhì)地疏松，呈嫩黃或乳白色.三種激素中2，4－D對(duì)三七愈傷組織增殖速率的影響最為顯著.

3 結(jié)論

單一激素2，4－D濃度為1.0mg/L時(shí)，能夠明顯促進(jìn)三七愈傷組織的快速增殖；將1.0mg/L 2，4－D與不同濃度的6－BA配比，在6－BA濃度小于1.0mg/L時(shí)，二者組合有利于三七愈傷組織的生長(zhǎng)，比單獨(dú)添加2，4－D生長(zhǎng)速度快；在最優(yōu)組合1.0mg/L 2，4－D＋0.5mg/L 6－BA 中添加不同濃度的KT，發(fā)現(xiàn)隨著KT濃度的增大，愈傷組織雖然保持一定的生長(zhǎng)速度，但其顏色卻有不同程度地加深，甚至出現(xiàn)褐化現(xiàn)象.根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，2，4－D 1.0mg/L＋6－BA 0.2mg/L＋KT 0.3mg/L是最適合三七愈傷組織生長(zhǎng)的激素組合，不但其鮮重、干重和增殖速率等指標(biāo)都達(dá)到最佳，且愈傷組織的色澤和質(zhì)地均良好，是后續(xù)建立三七懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞分化體系的優(yōu)良材料.

表2 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

表3 正交試驗(yàn)極差分析表

[1]肖培根.新編中藥志[M].北京:化學(xué)工業(yè)出社，2002.

[2]黃勇，張鐵，張文生，等.三七組織培養(yǎng)研究綜述[J].文山學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，25（6）:13－15.

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[4]張智慧，文國(guó)松，蕭鳳回，等.三七組織與細(xì)胞培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，19（4）:369－372.

[5]許鴻源，蒙愛(ài)東，李春霞，等.靈發(fā)素對(duì)三七愈傷組織發(fā)生和增殖的影響[J].中藥材，2004，27（1）:1－3.

[6]甘煩遠(yuǎn)，周立剛，鄭光植，等.三七愈傷組織分化的研究[J].云南植物研究，1993，15（1）:61－65.