劉曉丹 嚴景日 王平勇 張建盈 沈火林

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，設(shè)施蔬菜生長發(fā)育調(diào)控北京市重點實驗室，北京 100193）

茸毛是很多植物器官表面的毛狀體，植物表面茸毛狀物常與抗蟲、耐干旱、耐鹽、抗病及防御紫外線輻射等有著直接或間接的關(guān)系。棉花莖和葉片多茸毛性狀對棉蚜及其他刺吸式口器害蟲有較強的抗性，能有效減輕害蟲危害（郭香墨 等，1994）。多茸毛番茄對蚜蟲、煙粉虱、飛虱和美洲斑潛蠅等具有較好的驅(qū)避作用（鄭貴彬和郁和平，1986；Kennedy，2003；王志民 等，2006；高建昌 等，2007），可以顯著減少病毒病的發(fā)生，而且具有較好的耐澇性和耐高溫能力（鄭積榮 等，2010）。多毛番茄的腺毛還可以分泌甲基酮類物質(zhì)、倍半萜烯類物質(zhì)以及酰基糖類物質(zhì)（Burke et al.，1987），這些次生代謝物是主要的抗蟲性分泌物（Dimock & Kennedy，1983；Lin et al.，1987；Carter et al.，1989；Kenndy，2003）。辣椒主莖和葉片表面茸毛狀物的分布被認為與煙粉虱、疫病抗性有關(guān)（Egea-Gilabert et al.，2008；Syarifin et al.，2011），辣椒表皮茸毛可以通過減輕蚜蟲的危害來提高辣椒的抗病毒能力（尚宏芹，2004b），所以在辣椒抗性育種中茸毛有著重要的潛在利用價值。

劉金兵等（1998）研究表明，辣椒多茸毛對無毛茸為顯性遺傳。杜鋒（2004）研究發(fā)現(xiàn)辣椒茸毛性狀由1對顯性基因控制且具有不完全顯性特征，并篩選出了1個與茸毛基因連鎖的RAPD標記S1513，遺傳距離為3.98 cM。Kim等（2010）通過BAC文庫克隆找到1個控制辣椒茸毛的位點Ptl1，將其定位于10號染色體，開發(fā)了2個分子標記Tco和Tsca，離位點Ptl1的遺傳距離分別為0.33 cM和0.75 cM。

本試驗利用多茸毛和無茸毛材料及其F2群體，研究辣椒茸毛的形態(tài)特征和遺傳規(guī)律；并利用群體分離分析法（BSA）對F2群體進行基因分型，期望獲得與辣椒茸毛性狀緊密連鎖的分子標記，實現(xiàn)對茸毛性狀的基因定位，為進一步克隆辣椒茸毛基因并應(yīng)用于辣椒抗性育種提供科學(xué)依據(jù)。?

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試辣椒無茸毛材料為編號1788W的高代自交系，表現(xiàn)為莖、葉光滑無茸毛；多茸毛材料為編號1789M的高代自交系，表現(xiàn)為莖、葉多茸毛；1788W和1789M正反交產(chǎn)生F1，F(xiàn)1（1788W×1789M）自交產(chǎn)生F2群體；所有材料均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)辣椒課題組提供。

試驗材料均于2014年8月1日播種，其中1788W、1789M 各 50株，正反交 F180株，F(xiàn)2480 株，9月3日定植于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)園溫室內(nèi)。

1.2 辣椒茸毛性狀觀察與遺傳分析

定植30 d后，開始對1788W、1789M、F1及F2群體各單株的植株茸毛有無情況進行田間調(diào)查，并對調(diào)查結(jié)果進行卡方檢測。

定植45 d后，選取生長狀況一致的1788W、1789M植株各10株，分別在幼莖（靠近生長點的莖段）、成熟莖（自上而下第5莖節(jié)的莖段）、幼葉（離生長點最近的莖節(jié)上的葉片）、成熟葉片（自上而下第5莖節(jié)上的葉片）等4個不同部位取樣（尚宏芹，2009），徒手制片，每個部位觀察3個視野，在Olympus顯微鏡下觀察茸毛顯微結(jié)構(gòu)，并結(jié)合Lecia體視顯微鏡測定茸毛密度及長度。

1.3 辣椒茸毛性狀的基因定位

1.3.1 基因組DNA的提取 采用改良的CTAB法（Kabelka et al.，2002） 提 取 1788W、1789M、F1及F2群體各單株幼嫩葉片的基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；并將每個樣品提取的DNA濃度統(tǒng)一稀釋成 50 ng·μL–1。

1.3.2 分子標記開發(fā)與基因定位 通過辣椒基因組網(wǎng)站（http://pepper sequence.genomics.cn）下載辣椒基因組信息，采用Misa結(jié)合Primer3批量設(shè)計SSR引物。一般開發(fā)利用重復(fù)次數(shù)在10次以上的簡單重復(fù)序列結(jié)構(gòu)位，所用的SSR標記由北京三博引物合成公司合成。PCR擴增反應(yīng)體系（12 μL）包括：Mix 4.5 μL、ddH2O 5.5 μL、DNA 模 板 1.0 μL，R/F引物各0.5 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。采用 8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行分離和檢測（鄭釗，2009）。

1.3.3 連鎖分析方法 對所有群體田間調(diào)查結(jié)果的分離比進行卡方測驗，并對所有分子標記在群體上的分離模式進行卡方檢測。共顯性標記數(shù)據(jù)記錄時結(jié)果與1788W基因型表現(xiàn)一致的記錄為“a”，與1789M基因型一致的記錄為“b”，雜合型記錄為 “h”；顯性標記統(tǒng)計結(jié)果則是與1788W基因型表現(xiàn)一致的記錄為“a”，其他記錄為“c”，缺失的記錄為“-”。采用 JoinMap 4.0 軟件（van Ooijen，2006）進行標記連鎖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒茸毛形態(tài)特征

2.1.1 辣椒茸毛顯微形態(tài)觀察 田間觀察結(jié)果顯示，辣椒的茸毛性狀在植株的整個生育期都可以觀察到。

顯微觀察結(jié)果表明（圖1），莖和葉表皮茸毛由部分表皮細胞向上突起形成（圖1-a），每根表皮茸毛均由多個細胞串聯(lián)形成，細胞數(shù)量在2～30個之間，茸毛長度一般在0.2～1.0 mm之間，大多數(shù)集中在0.8 mm左右，且其長短取決于細胞數(shù)量的多少。茸毛上排列的細胞體積大小不等，彎曲部位的細胞體積小于其他細胞。茸毛上每個細胞都是生活細胞，可以觀察到有明顯的細胞核（圖1-b）。茸毛可分為兩種：一種為直立不分杈型，從基部細胞上直接生出1根茸毛，大多細長、頂端尖銳，辣椒莖和葉表皮茸毛絕大多數(shù)為此種；另一些茸毛在基部或者中部發(fā)生分杈，形成分杈茸毛（圖1-c），并且大多與單茸毛交織在一起，形成覆蓋在表皮表面的茸毛層。

圖1 辣椒茸毛細胞顯微結(jié)構(gòu)

2.1.2 辣椒茸毛分布特點 以無茸毛辣椒材料1788W作為對照進行田間觀測，多茸毛辣椒材料1789M的莖、葉片正反面、葉緣、葉脈均密布白色茸毛，植株上部茸毛多于下部。

在體視顯微鏡下觀察，多茸毛辣椒材料1789M靠近生長點的幼莖、成熟莖段、幼葉葉片正面及背面均著生大量茸毛；而無茸毛辣椒材料1788W不論幼葉還是莖，基本無茸毛著生（圖2）。

對多茸毛辣椒材料1789M不同部位上的茸毛進行田間觀察，發(fā)現(xiàn)不同部位茸毛密度不同：一般葉片背面比葉片正面多，靠近生長點的幼莖比下部成熟莖多，越靠近生長點茸毛越多。

由表1可知，無茸毛辣椒材料1788W的莖、葉基本無茸毛著生，密度約為0；而多茸毛辣椒材料1789M的莖、葉均密布茸毛，且不同部位的茸毛密度存在極顯著差異，以幼莖上的茸毛密度最大（約67.7根·cm-2），其次是成熟莖、葉片背面主脈，葉片正面主脈的茸毛密度最?。s18.5根·cm-2）。

圖2 1789M和1788W不同部位茸毛對比

表1 辣椒不同部位的茸毛密度

2.2 辣椒茸毛性狀的遺傳分析

田間調(diào)查結(jié)果顯示，F(xiàn)1（1788W×1789M）中有茸毛株數(shù)與無茸毛株數(shù)的表型分離比為75∶0，反交Fl（1789M×1788W）中有茸毛株數(shù)與無茸毛株數(shù)的表型分離比為78∶0，由此可知有茸毛性狀對無茸毛性狀為顯性，且該性狀的遺傳是由細胞核控制的；F2群體的茸毛性狀的分離結(jié)果為有茸毛株數(shù)∶無茸毛株數(shù)=350∶130，經(jīng)卡方測驗χ2為0.056，小于 χ2（0.05，1）=3.841，符合 3∶1 的預(yù)期分離比，說明辣椒茸毛性狀是由1對顯性基因控制的。

2.3 辣椒茸毛性狀的基因定位

從F2分離群體中隨機選擇10株有茸毛單株和10株無茸毛單株，將其稀釋后的DNA分別等量混合構(gòu)成有茸毛基因池和無茸毛基因池（曾躍輝 等，2013）。用均勻分布于辣椒12條染色體上的120對SSR標記對1788W、1789M、F1及有茸毛基因池和無茸毛基因池進行多態(tài)性分析，結(jié)果30%（36條）的隨機引物在1788W、1789M中表現(xiàn)出多態(tài)性；在有茸毛基因池和無茸毛基因池之間表現(xiàn)出多態(tài)性的引物有8對，其中3對位于辣椒10號染色體上，并且在1788W、1789M、F1及兩基因池之間表現(xiàn)出穩(wěn)定的多態(tài)性。同時用這3對SSR引物對F2群體單株進行檢測，確定其標記與辣椒茸毛性狀連鎖，初步將控制辣椒茸毛基因錨定于10號染色體上。

進一步利用基因組信息，在10號染色體上開發(fā)了200對SSR引物。采用PCR擴增和電泳檢測，發(fā)現(xiàn)僅有13對SSR標記表現(xiàn)出穩(wěn)定的多態(tài)性。結(jié)合分離群體分析法（BSA）對所有F2單株進行檢測和分析，采用Joinmap 4.0軟件對所有SSR標記（表2）和茸毛基因的連鎖關(guān)系進行分析，最后將茸毛基因定位在辣椒10號染色體上（圖3），位于標記ssr10-19和ssr10-21之間，且兩標記與該茸毛基因的相對遺傳距離分別為5.3 cM和13.3 cM。

表2 與辣椒茸毛基因連鎖的分子標記

圖3 辣椒茸毛性狀的分子標記連鎖圖

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，辣椒莖和葉片表皮茸毛的分布與番茄相似（柴敏和丁云花，2002b），都是體表密生白色茸毛，在各個器官均有分布；不同部位的茸毛密度不同，在辣椒上以幼莖的密度最大，其次是成熟莖，再次是葉片背面主脈、葉片正面主脈，這與前人（尚宏芹，2009；胡能兵 等，2010）在辣椒上的研究結(jié)論相符。番茄上的茸毛分為有腺體茸毛和無腺體茸毛（Luckwill，1943），控制番茄茸毛表達的基因不同，形態(tài)有所差異，Ln、Womz基因控制形成的茸毛以單茸毛為主，有少數(shù)二杈或三杈毛（柴敏和丁云花，2002a）；而Wo基因所產(chǎn)生的茸毛以分杈毛為主，常能觀察到似鹿角狀的多杈毛（柴敏和丁云花，2002b）。而本試驗未在辣椒上觀察到腺體茸毛，且辣椒的茸毛大多是以直立不分杈的單茸毛狀態(tài)存在，分杈毛很少。

本試驗結(jié)果表明，辣椒茸毛性狀屬于質(zhì)量性狀，受1對顯性核基因控制，而杜鋒（2004）的研究則認為辣椒茸毛性狀由1對顯性基因控制且具有不完全顯性特征。杜峰（2004）在田間等級劃分時發(fā)現(xiàn)了茸毛分離的連續(xù)性；張曉芬等（2013）同樣發(fā)現(xiàn)辣椒葉片與主莖茸毛存在密度差異。而本試驗中未出現(xiàn)密度明顯的連續(xù)性分離，F(xiàn)1、F2群體有茸毛植株的莖上茸毛密度大多集中在30～50根·cm-2之間，成熟葉片上的茸毛密度大多集中在15～25根·cm-2之間，因此筆者簡單地將其歸結(jié)為有 茸毛。

本試驗利用480株F2單株，結(jié)合群體分離分析法（BSA），將辣椒茸毛基因定位于10號染色體末端端粒處，這與Kim等（2010）的研究結(jié)果相符。本試驗找到的SSR標記ssr10-19與該茸毛基因的相對遺傳距離為5.3 cM，與杜鋒（2004）找到的RAPD標記S1315相比較，S1315雖然與辣椒茸毛基因的遺傳距離更近，但是該RAPD標記需要經(jīng)過PCR、酶切等相對復(fù)雜的過程，而本試驗根據(jù)基因組設(shè)計出的SSR標記只需要經(jīng)過PCR即可，簡化了檢測過程。Kim等（2010）通過構(gòu)建BCA文庫發(fā)現(xiàn)了1個控制茸毛形成的位點Ptl1，HpmsE031位于此位點之中，并開發(fā)了2個標記Tco和Tsca，離位點Ptl1的相對遺傳距離分別為0.33 cM和0.75 cM。本試驗在最初確定辣椒茸毛基因位于10號染色體后，就先用Tco和Tsca在父母本材料上進行擴增，結(jié)果無明顯差異；標記HpmsE03在本試驗中雖有差異但也不是緊密連鎖，可能是材料來源不同、群體大小不同、遺傳背景不同造成的。遺傳模式植物擬南芥中控制茸毛形成及生長的基因 遠 不 止 一 個（H ü lskamp et al.，1994；Szymanski et al.，2000；Walker et al.，2000；Schellmann et al.，2002），茄科植物番茄中控制茸毛性狀的基因已報道的就有Wo/Womz、Ln等，所以本試驗中控制辣椒茸毛的基因與Kim等（2010）報道的茸毛基因是否相同還有待深入研究。

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