饒本強(qiáng)，張繼英，婁亞敏，梅海霞，王艷璐

(1.信陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,河南 信陽 464000; 2.信陽農(nóng)林學(xué)院 生物技術(shù)系,河南 信陽 464000)

0 引言

多糖作為生物信息分子和功能分子的提出，它們的生理活性、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及工業(yè)化應(yīng)用成為研究熱點(diǎn)[1].微藻胞外多糖(Extracellular polysaccharides，EPS)是由藻類在生長過程中分泌到細(xì)胞外的水溶性多糖.這些釋放的水溶性EPS能夠很容易地從培養(yǎng)液中獲取，應(yīng)用于許多工業(yè)領(lǐng)域.目前對藻類EPS的研究，主要集中在淡水微藻和海洋微藻多糖的提取、分離純化和活性功能及其應(yīng)用等方面.研究較多的有螺旋藻(Spirulinasp.)、鹽藻(Dunaliellasalina)、小球藻(Chlorellasp.)和紫球藻(Porphyridiumcruentum)等[2].來自荒漠地表的土壤絲狀微藻，其胞外多糖是在極端環(huán)境條件下產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有抗輻射、抗干旱和抗鹽堿等多種生態(tài)學(xué)功能[3].特別是近年來研究發(fā)現(xiàn)了荒漠藍(lán)藻EPS抗腫瘤和抗衰老等功效，顯示了在醫(yī)藥領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值[4]，如免疫調(diào)節(jié)作用[5-7]、抗腫瘤[8-9]、抗病毒[10-11]、抗氧化與抗輻射[12-13]等.研究發(fā)現(xiàn)，許多荒漠絲狀藍(lán)藻在生長過程中能產(chǎn)生大量的EPS，相對其他藻類要高得多[14].以往對荒漠土壤微藻EPS的研究多集中在多糖組成、結(jié)構(gòu)和在荒漠生態(tài)功能方面，但有關(guān)荒漠微藻EPS合成的影響因素研究方面相對比較薄弱.本文以一種典型的荒漠絲狀藍(lán)藻——爪哇偽枝藻為實(shí)驗(yàn)材料，研究了不同環(huán)境因子對荒漠藍(lán)藻合成EPS的影響.

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)

爪哇偽枝藻(Scytonemajavanicum(Kütz.) Born et Flah)從荒漠土壤中分離、純化所得.采用BG-110液體培養(yǎng)基、光照強(qiáng)度40 μE·m-2·s-1，24 h連續(xù)光照，25±1 ℃，三角瓶中通氣培養(yǎng)至對數(shù)生長期(10 d)，用作下列試驗(yàn)處理.

1.2 試驗(yàn)處理

溫度試驗(yàn)：在光照培養(yǎng)箱中設(shè)置5 ℃、25 ℃、35 ℃進(jìn)行溫度處理，光照度2000 lx，光周期為12 h∶12 h.

測定鹽度(NaCl)、pH值、培養(yǎng)時(shí)間對S.javanicum胞外多糖分泌的影響.鹽度試驗(yàn)采用0.05、0.20、0.40 mol/L NaCl處理.pH試驗(yàn)中，將BG-110基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH分別調(diào)至5.5、7.5、11.5.培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)中，分別設(shè)置不同培養(yǎng)時(shí)間(5、15、30、45、60、90 d).上述試驗(yàn)于溫室條件下，(23±1) ℃，光強(qiáng)30 μE·m-2·s-1，24 h 連續(xù)光照，靜置培養(yǎng).

上述各種處理均在100 mL三角瓶中進(jìn)行，按接種量5%的比例將S.javanicum接種到盛有80 mL培養(yǎng)基的三角瓶中，然后培養(yǎng)20 d后取樣測定各種處理下S.javanicum分泌胞外多糖的含量.培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)中，按照相應(yīng)的時(shí)間取樣測定胞外多糖.每種處理設(shè)定3個(gè)平行.

1.3 實(shí)驗(yàn)測定

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

配制40 mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別取不同體積的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，加蒸餾水補(bǔ)足至2.0 mL稀釋成不同的葡萄糖濃度梯度，然后向各梯度中分別加入1 mL 9%的苯酚，搖勻，再加入5 mL濃硫酸，搖勻，反應(yīng)總體積8 mL.在室溫下放置30 min，測定OD490(以不加糖反應(yīng)液作空白對照)，以葡萄糖含量為縱坐標(biāo)，吸光值OD490為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.2 胞外多糖分泌量測定

各種環(huán)境因子處理下的S.javanicum胞外多糖分泌量測定采用苯酚-硫酸比色法[15].根據(jù)葡萄糖曲線計(jì)算出培養(yǎng)液中胞外多糖分泌量(mg/L).

1.3.3 胞外多糖粗品分析

將S.javanicum培養(yǎng)35 d 后離心，得到上清液，將上清經(jīng)過0.45 μm 微孔濾膜過濾，得脫細(xì)胞培養(yǎng)液.將脫細(xì)胞培養(yǎng)液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃減壓濃縮至500 mL，加3倍體積的無水乙醇于濃縮液中得白色絮狀沉淀，離心收集并用乙醇和丙酮重復(fù)洗滌2次，干燥，得胞外多糖粗提物.將胞外粗多糖稱干質(zhì)量，采用苯酚-硫酸法測定糖含量，并計(jì)算提取率.

1.4 顯微結(jié)構(gòu)與超微結(jié)構(gòu)觀察

取離心收集的藻體溶于新鮮的BG-110培養(yǎng)基中，于Nikon Eclipse E600光學(xué)顯微鏡(目鏡10×，物鏡40×)下觀察S.javanicum細(xì)胞形態(tài)，用OLYMPUS顯微攝影系統(tǒng)照相.分別取25 ℃和35 ℃處理的S.javanicum藻體適量，經(jīng)固定、脫水、包埋處理后，用LKB-NOVA 型超薄切片機(jī)切片.在厭氧條件下，飽和醋酸鉛雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色，以Tecnai型透射電鏡觀察細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化.

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 13.0 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析.多重比較采用Duncan法進(jìn)行，用大寫字母表示不同處理之間的差異達(dá)到顯著性水平(p<0.05)，用雙星號(hào)(**)表示極顯著性水平(p<0.01).文中所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(用誤差線顯示).

2 結(jié)果與分析

圖1為測定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線.橫坐標(biāo)表示吸光度值OD490，縱坐標(biāo)代表葡萄糖質(zhì)量(mg).將標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合為線性方程：y=0.165 4x+0.001 3(R2=0.996 4)，用于計(jì)算各種處理下S.javanicum胞外多糖分泌量.

圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig. 1ThestandardcurveofGlueose

2.1 溫度對爪哇偽枝藻分泌胞外多糖的影響

如圖2所示，在光照培養(yǎng)箱5 ℃和25 ℃處理下，經(jīng)過20 d培養(yǎng)后，S.javanicum胞外多糖分泌量無顯著性差異(p>0.05)，且均維持在較低的分泌量.35 ℃處理時(shí)，S.javanicum胞外多糖分泌量急劇增大，達(dá)到246.5 mg/L，極顯著高于5 ℃和25 ℃處理(p<0.01)，分別為5 ℃和25 ℃處理時(shí)胞外多糖分泌量的7.36倍和5.98倍.結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)母邷胤浅Ｓ欣赟.javanicum分泌胞外多糖，而較低的溫度則明顯抑制S.javanicum胞外多糖的分泌.

圖2溫度對偽枝藻胞外多糖分泌的影響

Fig. 2EffectsoftemperatureonEPSexudationofS.javanicum

2.2 鹽度對爪哇偽枝藻分泌胞外多糖的影響

圖3表明，在溫室條件下S.javanicum胞外多糖分泌量隨鹽濃度的增大而呈現(xiàn)增大趨勢.在培養(yǎng)液中，當(dāng)NaCl濃度為0.2 mol/L時(shí)，S.javanicum胞外多糖分泌量達(dá)到最大值(51.2 mg/L)，極顯著高于0.4 mol/L 鹽度(p<0.01)，顯著高于0.05 mol/L鹽度處理(p<0.05).在BG-110基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理下，S.javanicum胞外多糖分泌量與0.05 mol/L鹽度處理無顯著性差異(p>0.05).這表明，一定范圍的高鹽度能顯著促進(jìn)S.javanicum分泌胞外多糖，而高濃度的鹽脅迫則顯著抑制S.javanicum胞外多糖分泌.

圖3 NaCl濃度對偽枝藻胞外多糖分泌的影響

Fig. 3EffectsofconcentrationofNaClonEPSexudation

ofS.javanicum

2.3 pH值對爪哇偽枝藻分泌胞外多糖的影響

從圖4中可見， pH值在偏中性7.5時(shí)，S.javanicum胞外多糖分泌量達(dá)到最大值(44.7 mg/L)，顯著高于偏酸性(pH=5.5)和偏堿性(pH=11.5)處理下的胞外多糖分泌量(p<0.05)，而與BG-110基礎(chǔ)培養(yǎng)下S.javanicum胞外多糖分泌量無顯著性差異(p>0.05).

圖4 pH值對偽枝藻胞外多糖分泌的影響

Fig.4EffectsofpHvalueonEPSexudationofS.javanicum

2.4 培養(yǎng)時(shí)間對爪哇偽枝藻分泌胞外多糖的影響

測定了培養(yǎng)5、15、30、45、60和90 d的S.javanicum培養(yǎng)液中的胞外多糖分泌量.圖5顯示，S.javanicum胞外多糖分泌量隨時(shí)間逐漸增大，且與S.javanicum的生長時(shí)期密切相關(guān).在對數(shù)生長期0～5 d的初始期內(nèi)，S.javanicum開始緩慢分泌胞外多糖，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)期的中后期(10～15 d)時(shí)開始快速分泌胞外多糖.當(dāng)S.javanicum進(jìn)入穩(wěn)定生長期(15～30 d)后，開始大量分泌胞外多糖到培養(yǎng)液中.在穩(wěn)定生長期之后的很長時(shí)間內(nèi)(30～90 d)，隨著培養(yǎng)液中營養(yǎng)基質(zhì)的耗盡和細(xì)胞的老化，S.javanicum胞外多糖又進(jìn)入緩慢分泌期，而且這種胞外多糖緩慢地增長，可能還由于S.javanicum細(xì)胞裂解死亡后胞內(nèi)多糖釋放到培養(yǎng)液中的緣故.

圖5培養(yǎng)時(shí)間對偽枝藻胞外多糖分泌的影響

Fig. 5EffectsofculturetimeontheEPSexudationof

S.javanicum

2.5 爪哇偽枝藻胞外多糖粗品分析

經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并經(jīng)乙醇沉淀、丙酮洗滌、冷凍干燥后，得胞外多糖粗品為白色粉末，膨松、無嗅無味、易溶于水、略溶于低濃度乙醇.與硫酸-苯酚試劑反應(yīng)呈磚紅色.胞外多糖粗品提取產(chǎn)量可高達(dá)309.3 mg/L，其糖含量達(dá)70.42%(以葡萄糖為對照)，提取率為72.59%.

2.6 爪哇偽枝藻形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

采用光鏡對溫室條件下BG-110基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的S.javanicum進(jìn)行形態(tài)觀察，并采用對25 ℃和35 ℃處理的S.javanicum進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察.光鏡下，S.javanicum藻絲體發(fā)達(dá)、纖細(xì)，見圖6A(×4倍)，呈現(xiàn)假分支，即“偽枝”，藻細(xì)胞呈念珠狀排列在共同的膠鞘中，見圖6B(×10倍)；透射電鏡下，35 ℃處理S.javanicum藻細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)保持完好，好于25 ℃處理的細(xì)胞形態(tài)，見圖6C(25 ℃處理，×3500倍)和圖6D(35 ℃處理，×1700倍).說明適度的高溫有利于S.javanicum細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定.這與35 ℃處理下S.javanicum胞外多糖分泌量最大的測定結(jié)果相一致.

圖6爪哇偽枝藻形態(tài)結(jié)構(gòu)

Fig. 6MorphologicalstructuresofS.javanicum

3 討論

與植物多糖相比，微藻多糖具有生產(chǎn)周期短安全性高，毒副作用小和理化特性獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、石油、化工和環(huán)保等多個(gè)領(lǐng)域.研究表明，藍(lán)藻釋放的EPS是復(fù)雜的雜聚物，約80%以上由6～10種不同的單糖組成[16].研究表明[17]，培養(yǎng)條件(如光照、營養(yǎng)、溫度等)、生長階段和培養(yǎng)年齡都對藍(lán)藻向外分泌胞外多糖有影響.一些微生物胞外多糖在營養(yǎng)不平衡(如高的C、N比)和較低培養(yǎng)溫度的條件下有利于其合成[18].本研究中發(fā)現(xiàn)，S.javanicum在較低溫度(5 ℃和25 ℃)下不利于該藻胞外多糖的分泌，而在35 ℃高溫下卻能分泌更多的胞外多糖.吳沛沛等研究發(fā)現(xiàn)[18]，采用不同高溫處理S.javanicum時(shí)，隨溫度升高，S.javanicum胞外多糖分泌量呈現(xiàn)出逐漸增大的趨勢，即使在40 ℃的高溫條件也能夠分泌大量的胞外多糖，且S.javanicum最大光化學(xué)效率Fv/Fm和實(shí)際光化學(xué)效率ΦPSII在35 ℃下表現(xiàn)出最大值.S.javanicum在常溫下培養(yǎng)驟然降至低溫時(shí)，其胞外多糖的分泌量顯著下降，而經(jīng)過低溫適應(yīng)后再降至更低溫度時(shí)，胞外多糖的分泌卻出現(xiàn)了大幅度增加[19].本研究也發(fā)現(xiàn)，與較低溫度(25 ℃)相比，35 ℃的高溫更有利于S.javanicum細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的保持和穩(wěn)定，這也初步證實(shí)了S.javanicum能夠適應(yīng)35 ℃的高溫條件并且生長良好，從而能在高溫下分泌更多的胞外多糖.

當(dāng)從低鹽度(0.05 mol/L NaCl)增至較高鹽度(0.2 mol/L NaCl)時(shí)，S.javanicum胞外多糖分泌量隨鹽度增加而顯著增大(P<0.05),而在高鹽度脅迫條件下(0.4 mol/L NaCl)則明顯抑制了S.javanicum胞外多糖分泌.這說明鹽度在一定濃度范圍內(nèi)有利于S.javanicum胞外多糖的分泌，而更高鹽度則抑制了S.javanicum胞外多糖的合成.因此，S.javanicum胞外多糖的分泌存在最適鹽度，類似的結(jié)果也出現(xiàn)在李朋富等人的研究中[20].本研究表明，pH值對S.javanicum分泌胞外多糖有一定的影響.在中性偏中性條件下(pH=7.5)，S.javanicum胞外多糖的分泌量明顯高于其他pH下胞外多糖的分泌(P<0.05).可見，pH中性偏堿性時(shí)，利于該藻胞外多糖的合成.在對紫球藻的研究中發(fā)現(xiàn)，pH也能影響其胞外多糖的合成，當(dāng)pH為偏中性時(shí)胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大[21].

培養(yǎng)時(shí)間對S.javanicum胞外多糖分泌量有顯著影響，其胞外多糖分泌量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，且在生長后期(靜止期或穩(wěn)定期)胞外多糖積累達(dá)到較高水平(圖5).在對多種微藻合成胞外多糖的研究中也發(fā)現(xiàn)，微藻一般在對數(shù)生長期的后期和穩(wěn)定期時(shí)它們的多糖產(chǎn)率最高[2].究其原因，主要是由于在培養(yǎng)早期，S.javanicum需要消耗細(xì)胞中的養(yǎng)分用于細(xì)胞營養(yǎng)生長，在生長中后期開始在藻細(xì)胞中合成多糖，并釋放到培養(yǎng)基質(zhì)中.因此，生長后期的胞外多糖分泌量明顯高于生長前期.我們推測，微藻胞外多糖的分泌機(jī)制與生長周期可能存在密切關(guān)系，微藻在整個(gè)生長周期過程中都能不斷地合成并釋放胞外多糖，但在進(jìn)入穩(wěn)定期后分泌量增大.本文研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)論.一些學(xué)者對屬于藍(lán)藻胞外多糖的分離、純化等進(jìn)行了研究[22-23].值得指出的是，本研究直接采用離心、過濾去除S.javanicum細(xì)胞后的上清液進(jìn)行濃縮，用于制備胞外粗多糖，并測定胞外多糖粗品中的糖含量，而沒有考慮粗多糖中蛋白質(zhì)、色素等其他因素的干擾，這可能對于實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果造成一定的偏差.研究指出[24]，荒漠藻類胞外多糖對于保護(hù)藻細(xì)胞免受極端環(huán)境的脅迫中也起到重要作用，這些胞外多糖控制藻類細(xì)胞水分的吸收和輸出，使細(xì)胞壁在吸漲和收縮過程中免受傷害.此外，藻類胞外多糖可能扮演著保護(hù)藻類自身和其他生物的角色，以抵抗低溫、干旱、紫外線、抗生素或被原生動(dòng)物吞食.

4 結(jié)論

適當(dāng)?shù)母邷赜欣赟.javanicum細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，表明S.javanicum有很好的高溫耐受性，且適當(dāng)?shù)母邷啬軌蝻@著促進(jìn)S.javanicum合成大量的胞外多糖.鹽度在一定濃度范圍內(nèi)能夠誘導(dǎo)S.javanicum胞外多糖的分泌，但高鹽度脅迫抑制了S.javanicum胞外多糖的合成.pH中性偏堿性時(shí)，利于該藻胞外多糖的合成.生長周期對S.javanicum胞外多糖分泌量有顯著影響，其胞外多糖分泌量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，且在生長后期(靜止期或穩(wěn)定期)胞外多糖積累達(dá)到較高水平.