梁 峰 王 莉，2 夏保密 宋兆齊，2 張淑紅，2 劉秀花，2

（1.商丘師范學(xué)院 生物精煉河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 商丘 476000；2.商丘師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 商丘 476000）

微生物油脂（microbial oils）又稱單細(xì)胞油脂（single cell oil，SCO），是由酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類等微生物在一定條件下利用碳水化合物合成的一類物質(zhì)。微生物油脂主要是由不飽和脂肪酸（PUFAs）組成的甘油三酯（TAG），在脂肪酸組成上與植物油（如菜籽油、棕櫚油、大豆油等）相似。如果油脂積累量超過(guò)細(xì)胞總量的20%，即稱為產(chǎn)油微生物［1］。微生物油脂的研究和開發(fā)，不僅豐富了傳統(tǒng)的油脂工業(yè)技術(shù)，而且是工業(yè)化生產(chǎn)油脂的一個(gè)重要途徑［2］。

目前，能夠被用來(lái)生產(chǎn)油脂的微生物種類有酵母菌、霉菌、細(xì)菌和藻類等，其中以霉菌和藻類的真核生物居多。霉菌中脂肪酸類型要比酵母菌豐富，并含有豐富的γ-亞麻酸、花生四烯酸等多種不飽和脂肪酸［3］。同時(shí)，霉菌可以利用秸稈、食品工業(yè)廢棄物等纖維素物質(zhì)，分解產(chǎn)生單糖，并以此作為合成油脂的原料。在人口快速增長(zhǎng)的情況下，研究并優(yōu)化霉菌的產(chǎn)油條件，確定最經(jīng)濟(jì)高效的葡萄糖培養(yǎng)濃度，對(duì)于開辟新油源—微生物油脂具有重要的理論和實(shí)際意義［4］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的?，F(xiàn)青霉P1（Penicillium flavidorsum）、土壤青霉P3（Penicillium terrestre）、綠色木霉L1（Trichoderma viride）、紅色脈孢霉H1（Neurosporspp）均由本實(shí)驗(yàn)室收集保藏。

1.2 培養(yǎng)基

GMY 培養(yǎng)基［5］：磷酸二氫鉀8g，硫酸鎂0.5g，酵母提取 物3g，葡 萄 糖40g，水1L 調(diào) 至PH，5.5。GMY40、GMY60、GMY80、GMY100、GMY120（每升GMY 發(fā)酵液中葡萄糖的含量分別為40g、60g、80g、100g、120g），則發(fā)酵液中葡萄糖濃度分別為：4%、6%、8%、10%、12%。在115℃條件下高壓蒸汽滅菌30min。

1.3 發(fā)酵條件

吸取1ml 無(wú)菌水，分別注入斜面培養(yǎng)的四株霉菌試管中，吹打，晃動(dòng)試管；將孢子液吸到1.5ml 的離心管中，反復(fù)吹打，使孢子充分分散；用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，若孢子濃度過(guò)高，則需要倍比稀釋，最終保證每100ml發(fā)酵液的接種量為108個(gè)孢子［6］。在無(wú)菌條件下，分別接種P1、P3、L1、H1的孢子懸液于GMY40、GMY80、GMY120的發(fā)酵液中，在30℃、225r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)3天，每隔24h進(jìn)行定性定量檢測(cè)，跟蹤觀察4天。

1.4 油脂滴染色與顯微觀察

采用蘇丹黑染色方法進(jìn)行染色，并通過(guò)顯微鏡拍照獲得霉菌在不同培養(yǎng)時(shí)間積累油脂滴的狀況［7］。

1.5 生物量的測(cè)定

每隔24h，利用真空水循環(huán)式抽濾泵，過(guò)濾收集菌絲體，再用真空凍干機(jī)凍干［8］。恒重后，得到菌體和稱量瓶的總重m2；在收集菌體前，先恒重稱量瓶，計(jì)為m1。那么，菌體的生物量M=m2-m1。

1.6 發(fā)酵液中殘?zhí)橇康臏y(cè)定

在接種前，先用阿貝折射儀檢測(cè)發(fā)酵液中初始糖含量，計(jì)為W1。在培養(yǎng)至1d、2d、3d、4d 時(shí)，分別吸取發(fā)酵液，利用阿貝折射儀檢測(cè)發(fā)酵液中殘余糖含量，計(jì)為W2。那么，消耗的葡萄糖量為：mG（消耗糖量）=W1-W2；葡萄糖轉(zhuǎn)化為生物量的效率（%）=mb（生物量）/mG（消耗糖量）×100%［9］。

1.7 油脂含量的測(cè)定

油脂能溶于有機(jī)溶劑如乙醚、石油醚等，且有機(jī)溶劑具有易揮發(fā)性。索氏抽提器可以進(jìn)行回流蒸發(fā)和蒸餾，反復(fù)抽提樣品中的油脂［10］。菌體烘干，研磨粉碎后取一定重量的干菌體粉末用濾紙包好，放入索氏抽提器的提取管中，以30～60℃沸程的乙醚為抽提劑，取下抽提瓶，在80℃水浴中揮發(fā)掉殘留石油醚，再置于95～105℃烘箱中烘干，準(zhǔn)確稱量粗油脂重量（m）［11-13］。

油脂含量（%）=m（油脂量）/M（生物量）×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 霉菌在不同葡萄糖濃度下產(chǎn)油能力比較

培養(yǎng)3d，收獲菌體，烘干后，利用索氏抽提法提取油脂，計(jì)算油脂產(chǎn)量（g/L）變化見表1。隨著葡萄糖濃度的升高，四株霉菌的油脂產(chǎn)量逐漸減小，在4%的糖濃度下積累的油脂量最多。其中，L1的油脂產(chǎn)量最大。

表1 四株霉菌的油脂產(chǎn)量（g/L）及細(xì)胞油脂含量（%）

表1所示四株霉菌的油脂含量M（%）變化，可知，L1、P1、P3菌株在葡萄糖濃度為4%的發(fā)酵液中，油脂含量較高；H1 菌株在葡萄糖濃度為8%的發(fā)酵液中，油脂含量較高。L1 菌株油脂含量卻最高，說(shuō)明L1 合成油脂的能力最大。L1 和P1 菌體積累的油脂量與生物量呈正比，隨著糖濃度的升高，生物量逐漸降低，油脂量也逐漸降低；P3 在4%的濃度下菌體合成油脂的能力最大；H1 在8%的糖濃度下積累的生物量較少，但合成油脂的能力卻相對(duì)較大，與相關(guān)報(bào)道一致［14］。

圖1 四株霉菌利用葡萄糖轉(zhuǎn)化為油脂的效率

如圖1 所示不同霉菌葡萄糖-油脂的轉(zhuǎn)化率（%）差異。隨著葡萄糖濃度的升高，四株霉菌的葡萄糖-油脂轉(zhuǎn)化率均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)；在葡萄糖濃度為4%的發(fā)酵液中，L1菌株的葡萄糖-油脂轉(zhuǎn)化率最高。隨著葡萄糖濃度升高，霉菌轉(zhuǎn)化糖的能力卻下降，消耗的糖并沒有轉(zhuǎn)化為更多的油脂和生物量，而是被呼吸作用消耗掉。

2.2 菌株L1產(chǎn)油條件優(yōu)化

2.2.1 L1在不同糖濃度下積累生物量的能力。為了確定最經(jīng)濟(jì)高效的葡萄糖濃度，使霉菌具有最佳的油脂合成能力，在葡萄糖濃度分別為4%、6%、8%、10%、12%的發(fā)酵液中，培養(yǎng)L1，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和定性定量檢測(cè)。在1d、2d、3d、4d 時(shí)，分別收獲菌體，干燥后恒重，測(cè)定生物量（g），如圖2所示。

圖2 L1在不同葡萄糖濃度條件下的生物量

從圖4 可知，在葡萄糖濃度為4%的發(fā)酵條件下，L1菌體的生物量較大；在12%的糖濃度下，L1 的生物量最小；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體的生物量逐漸增加；在4d時(shí)，L1積累的生物量達(dá)到最大值。

2.2.2 菌體L1 在不同糖濃度條件下葡萄糖消耗差異。分別在1d、2d、3d、4d 時(shí)，吸取發(fā)酵液，測(cè)得殘?zhí)橇?，并?jì)算L1在不同糖濃度下消耗的葡萄糖量，如圖3所示。

圖3 L1在不同糖濃度下消耗的葡萄糖量

由圖3可知，隨著發(fā)酵液中糖濃度的增加、培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，L1 消耗的葡萄糖量也在增加。在4d 時(shí)，消耗糖最多，且L1在含糖量為8%、10%、12%的發(fā)酵液中消耗的糖量幾乎持平。

圖4 L1利用葡萄糖轉(zhuǎn)化為生物量的效率

從圖4可知，隨著發(fā)酵液中葡萄糖濃度的增加，L1對(duì)葡萄糖-生物量的轉(zhuǎn)化率逐漸減小。在葡萄糖濃度為4%時(shí)，L1 利用葡萄糖轉(zhuǎn)化為生物量的效率最大。在3d 以后，糖濃度10%、12%的發(fā)酵液中，L1 對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率幾乎持平。糖含量越高，L1消耗的葡萄糖量越多，積累的生物量卻減少，說(shuō)明L1只能利用一部分葡萄糖積累生物量。

2.2.3 不同糖濃度L1脂肪積累的差異。分別在培養(yǎng)1d、2d、3d、4d時(shí)，獲得干菌體，利用索氏抽提法，得到L1在不同葡糖糖濃度條件下的油脂產(chǎn)量（g/L），如表2所示。

表2 L1的油脂產(chǎn)量（g/L）和細(xì)胞含油量

由表2可知，隨著葡萄糖濃度的增加，L1菌體的油脂產(chǎn)量逐漸降低；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，油脂產(chǎn)量逐漸增加。在4d時(shí)，L1在葡萄糖濃度為4%的發(fā)酵條件下，具有最高的油脂產(chǎn)量。在3d 以后，L1 在糖濃度為6%、8%、10%的條件下油脂產(chǎn)量幾乎持平，油脂積累已經(jīng)達(dá)到最大值。在12%的糖濃度下，L1 的油脂產(chǎn)量在3d 最大，而在4d有所下降，油脂被分解消耗掉。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，油脂含量先升高后降低，在3d 時(shí)達(dá)到最大值，為38.62%。L1的油脂產(chǎn)量與生物量呈正比，隨葡萄糖濃度的升高而降低，在高濃度的葡萄糖條件下油脂含量反而不高。

圖5 L1利用葡萄糖轉(zhuǎn)化為油脂的效率

由圖5可知，隨著葡萄糖濃度的升高，L1菌株利用葡萄糖轉(zhuǎn)化為油脂的效率逐漸降低。在葡糖糖濃度為4%的發(fā)酵條件下，L1消耗較少的葡萄糖卻產(chǎn)生較多的油脂，轉(zhuǎn)化率最大。葡萄糖濃度越高，轉(zhuǎn)化為油脂的效率卻越低，說(shuō)明高濃度的葡萄糖會(huì)抑制油脂的合成，大量的葡萄糖通過(guò)呼吸作用而消耗。

2.2.4 菌體L1 的細(xì)胞內(nèi)油脂滴連續(xù)變化。葡萄糖濃度為4%、6%、8%、10%、12%發(fā)酵條件下，分別在1d、2d、3d、4d時(shí)，對(duì)L1的菌絲體進(jìn)行蘇丹黑染色。鏡檢結(jié)果如圖6 所示。由圖6 可知，在相同的發(fā)酵時(shí)間，葡萄糖濃度越高，L1菌體積累的油脂滴密度越低，含量越少。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，L1積累的油脂逐漸增多，在4d時(shí)，油脂滴變大數(shù)目變小。在4%的糖濃度條件下，油脂滴密度較大，含量較多。說(shuō)明高濃度的葡萄糖反而不利于油脂的積累，甚至?xí)钟椭暮铣赡芰Α?/p>

圖6 L1在不同葡萄糖濃度下的油脂滴染色結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

本研究應(yīng)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法對(duì)霉菌進(jìn)行跟蹤觀察，探究不同葡萄糖濃度的發(fā)酵條件對(duì)霉菌產(chǎn)油能力的影響。綜上所述，葡萄糖濃度會(huì)明顯影響霉菌的生物量、油脂積累量和葡萄糖轉(zhuǎn)化率。隨著葡萄糖濃度的升高，霉菌消耗的葡萄糖量逐漸增大，而霉菌的生物量并不一定增加；葡萄糖濃度越高，利用葡萄糖增加生物量和產(chǎn)生油脂的能力受到限制，大量的葡萄糖通過(guò)呼吸作用而被消耗，造成資源和能源的浪費(fèi)。當(dāng)培養(yǎng)基初始葡萄糖濃度過(guò)高，會(huì)出現(xiàn)明顯的抑制作用，這可能是由于培養(yǎng)基的滲透壓力隨濃度的升高而增加，而到后期葡萄糖被消耗，滲透壓的劇烈改變使菌體細(xì)胞不能耐受，導(dǎo)致菌體不能正常生長(zhǎng)，繼而影響代謝水平，造成發(fā)酵周期延長(zhǎng)、產(chǎn)率降低。葡萄糖濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致菌體自身的代謝非常旺盛，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，影響到微環(huán)境的pH，葡萄糖的代謝產(chǎn)物也會(huì)抑制其他產(chǎn)物的合成。

通過(guò)對(duì)不同葡萄糖濃度條件下，四株霉菌的生長(zhǎng)狀況和產(chǎn)油情況進(jìn)行定性、定量分析，可以得出以下結(jié)論：四株霉菌中，L1的產(chǎn)脂能力最高；L1在葡萄糖濃度為4%的發(fā)酵條件下，油脂產(chǎn)量最佳為2.598g/L，油脂含量為38.62%，具有最大的油脂合成能力，且較低濃度時(shí)油脂積累較好，預(yù)示工業(yè)發(fā)酵可采用流加的工藝，下一步將就此開展研究。然而，本研究發(fā)酵底物為葡萄糖，當(dāng)?shù)孜锾鎿Q為其他糖（如木糖）或者混合糖時(shí)產(chǎn)油能力如何？這個(gè)問(wèn)題將在后續(xù)研究中繼續(xù)探討。

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