劉小芹，羅育，曾麒燕（廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧　530021）

白桂木凝集素基因的5’RACE與3’RACE擴(kuò)增及序列分析

劉小芹，羅育，曾麒燕
（廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧530021）

摘要：［目的］對(duì)白桂木凝集素基因進(jìn)行擴(kuò)增及序列分析。［方法］采用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，擴(kuò)增得到白桂木凝集素（AHL）基因的保守區(qū)域、5’末端及3’末端。用Vector NTI軟件將測(cè)序得到的AHL cDNA的保守區(qū)域、5’末端、3’末端進(jìn)行校正、拼接得到完整AHL cDNA序列。［結(jié)果］全長(zhǎng)含有933個(gè)核苷酸。其推導(dǎo)的氨基酸序列NCBI做BLAST比對(duì)，相似度高達(dá)70%～80%。［結(jié)論］對(duì)白桂木凝集素基因的cDNA序列進(jìn)行研究，可為進(jìn)一步從分子水平探明白桂木凝集素的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：白桂木凝集素；RACE技術(shù)；基因克??；序列分析

白桂木（Artocarpus hypargyreus Hance）系?？撇_蜜屬常綠喬木，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的樹(shù)種，主要分布于桂東南地區(qū)。其根可入藥，味甘、淡，性溫，具有祛風(fēng)利濕、活血通絡(luò)等功效［1］，在民間應(yīng)用較廣泛。白桂木種子富含白桂木凝集素（Artocarpus hypargyreus Hance lectin，AHL），其藥用價(jià)值已經(jīng)引起醫(yī)藥學(xué)界的注意。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，AHL能夠促進(jìn)小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞（BmDC）的分化成熟，能夠抑制人急性白血病T淋巴細(xì)胞（Jurkat T）及小鼠T淋巴瘤細(xì)胞（EL-4）的增殖［2］；并對(duì)白桂木基因組DNA的提取方法進(jìn)行了研究［3］。本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道AHL基因的cDNA序列，為今后進(jìn)一步從分子水平探明AHL的作用機(jī)制及其在臨床疾病防治等方面的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定良好的理論基礎(chǔ)。

1　實(shí)驗(yàn)方法

1.1材料新鮮的白桂木葉子于2013年7月采自廣西藥用植物園，選取其中嫩、大、薄的葉片經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。Easypure Plant RNA Kit（北京全式金），RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas），Taq DNA聚合酶，聚乙烯吡 咯 烷 酮 （Polyvinylpyrrolidone，PVP），pMD-18T載 體（Takara），SMARTTMRACE cDNA Amplification kit（BD Bioscience Clontech Company），DNA回收試劑盒（北京全式金），引物合成和測(cè)序分別由深圳華大基因科技有限公司和上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2白桂木葉片總RNA抽提參考北京全式金公司的Easypure Plant RNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。

1.3AHL基因cDNA保守區(qū)域的獲得根據(jù)NCBI網(wǎng)站上已公布的木菠蘿凝集素家族的mRNA序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增AHL基因cDNA保守區(qū)域的特異性引物，見(jiàn)表1。以白桂木總RNA為模板，按照RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas）的說(shuō)明方法反轉(zhuǎn)錄獲得白桂木cDNA。以獲得的白桂木總cDNA為模板，以WBF、WBR為上、下游引物，擴(kuò)增AHL保守區(qū)域cDNA片段。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃5 min；94℃30 s；42℃30 s；72℃1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。膠回收試劑盒純化回收，將純化后的白桂木PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

表1　 用于擴(kuò)增AHL基因cDNA保守區(qū)域的引物

1.4AHL基因的5’RACE以AHL基因的cDNA保守區(qū)域的序列為模板，用Primer 5.0設(shè)計(jì)了兩條特異性引物W51、W52，見(jiàn)表2。按照SMARTTMRACE cDNA Amplification kit說(shuō)明書(shū)操作，合成5’-ready cDNA，以5’-ready cDNA為模板，以W51和UPM（試劑盒中提供）為引物，進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃5 min；94℃30 s；68℃30 s；72℃3 min，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；72℃10 min。將PCR產(chǎn)物用TE緩沖液（試劑盒中提供）稀釋50倍作為巢式PCR的模板，以W52和NUP（試劑盒中提供）為引物，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。巢式PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃5 min；94℃30 s；68℃30 s；72℃3 min，共進(jìn)行20個(gè)循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表2　AHL 5’RACE引物

1.5AHL基因的3’RACE以AHLcDNA保守區(qū)域的序列為模板，用Primer 5.0設(shè)計(jì)3’RACE的引物W31、W32，見(jiàn)表3。按照SMARTTMRACE cDNA Amplification kit說(shuō)明書(shū)操作，合成3’-ready cDNA，以3’-ready cDNA為模板，以W31和UPM（試劑盒中提供）為引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃5 min；94℃30 s；68℃30 s；72℃3 min，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；72℃10 min。將PCR產(chǎn)物用TE緩沖液（試劑盒中提供）稀釋50倍作為巢式PCR的模板，以W32和NUP（試劑盒中提供）為引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。巢式PCR的反應(yīng)程序?yàn)?94℃5 min；94℃30 s；68℃30 s；72℃3 min，共進(jìn)行20個(gè)循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表3　AHL 3’RACE引物

1.6目的片段測(cè)序及序列分析5’RACE、3’RACE擴(kuò)增條帶切膠回收，連接于pMD-18T載體上，小量抽提質(zhì)粒DNA，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。采用Vector NTI對(duì)AHL基因的cDNA的保守區(qū)域、5’末端、3’末端進(jìn)行校正、拼接得到完整AHL cDNA序列。將其推導(dǎo)的AHL氨基酸序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)做BLAST比對(duì)。

2　結(jié)果與分析

2.1白桂木總RNA提取與檢測(cè)利用試劑盒法抽提的白桂木葉片總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，A260/A280比值為1.82，表明所提取的RNA純度很高。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表明，抽提的白桂木葉片總RNA沒(méi)有受到基因組DNA和蛋白質(zhì)的污染，28 s核糖體RNA和18 s核糖體RNA的帶型清晰，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，兩條帶的亮度比基本呈現(xiàn)2∶1的關(guān)系，說(shuō)明RNA完整性比較好。如圖1。

圖1　白桂木葉片總RNA提取凝膠電泳圖

2.2AHL基因的cDNA保守區(qū)域擴(kuò)增AHL cDNA保守區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)一條500 bp左右的條帶，如圖2。經(jīng)測(cè)序得保守區(qū)域含有478個(gè)核苷酸。

圖2　AHL 基因cDNA 保守區(qū)域瓊脂糖凝膠電泳

2.3AHL RACE擴(kuò)增和序列分析AHL 5’RACE-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)一條500 bp左右的條帶，測(cè)序結(jié)果為403個(gè)核苷酸，3’RACE-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)一條700bp左右的條帶，測(cè)序結(jié)果為631個(gè)核苷酸。電泳結(jié)果如圖3。經(jīng)Vector NTI校正、拼接得到ALL cDNA全長(zhǎng)為952個(gè)核苷酸，如圖4。將推導(dǎo)的AHL氨基酸序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)做BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)AHL與同為?？频哪静ぬ}凝集素Jacalin的四種同工凝集素（登陸號(hào)為: AAA32677.1，AAA32678.1，AAA32679.1，AAA32680.1）及黑桑凝集素MornigaG的兩種同工凝集素（登陸號(hào)為:AAL09163.1，AAM90088.1）相似度最高。相似度為70%～80%。如圖5。

圖3　RACE-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

圖4　AHL的mRNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖5　AHL與木菠蘿凝集素家族多序列對(duì)比

3　討論

伴隨著生物科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，近年來(lái)產(chǎn)生了一系列克隆新基因的方法與技術(shù):圖譜克隆技術(shù)，轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)，mRNA差異顯示技術(shù)，基因組減法技術(shù)以及cDNA文庫(kù)篩選技術(shù)等［1］。SMARTTM3’RACE的原理為:以連接有SMART寡核苷酸序列的通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作為鎖定引物，與mRNA3’末端的poly（A）尾結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。再以基因特異性引物GSP1作為上游引物，用含有部分接頭序列的通用引物UPM作為下游引物，以獲得的第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因的3’末端cDNA序列。SMARTTM5’RACE的原理為:以O(shè)ligo（dT）30MN作為鎖定引物在逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV的作用下，與mRNA3’末端的poly（A）尾結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。此逆轉(zhuǎn)錄酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄到達(dá)cDNA第一鏈的5’末端時(shí)，會(huì)在其末端自動(dòng)加上3～5個(gè)dC殘基，退火后，dC和含有Oligo（dG）的SMART寡核苷酸序列的通用接頭引物配對(duì)，轉(zhuǎn)換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭。以SMART cDNA第一鏈作為模板，以含有部分接頭序列的通用引物UPM和基因特異性引物GSP2為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增目的基因5’末端序列。

根據(jù)邢桂春等［4］的研究發(fā)現(xiàn)，使用CLONTECH的SMARTTMRACE技術(shù)能夠獲得更長(zhǎng)的片段。SMART RACE采用了自動(dòng)熱啟動(dòng)的技術(shù)，通過(guò)在Advantage 2 Ploymerase中加入其單克隆抗體，使得在溫度上升到抗體失活之前，抗體可以阻礙聚合酶的活性，使實(shí)驗(yàn)取得了較好的結(jié)果［5］。特異性引物的設(shè)計(jì)是RACE反應(yīng)能否成功的關(guān)鍵因素［6］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)26～28個(gè)堿基，GC含量大于50%，Tm值大于70℃的引物來(lái)提高反應(yīng)的特異性。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行首輪RACE-PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物上樣于1%瓊脂糖凝膠，電泳檢驗(yàn)無(wú)擴(kuò)增條帶，分析其原因可能因?yàn)槟０鍧舛冗^(guò)低，退火溫度過(guò)低，PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多等。針對(duì)上述可能原因，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)同等條件下設(shè)置不同量的模板，進(jìn)行梯度PCR摸索退火溫度，減少循環(huán)次數(shù)等，均未獲得特異性條帶。徐燁等［6］研究發(fā)現(xiàn)，把巢式PCR和RACE技術(shù)相結(jié)合能夠提高克隆的精準(zhǔn)度。本實(shí)驗(yàn)將第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋50倍后作為模板，以NUP和NGSP為引物，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)獲得了理想的條帶。巢式PCR（nested PCR）是由普通PCR技術(shù)衍生出的一種新的PCR技術(shù)，在分子生物學(xué)理論研究與醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面的研究應(yīng)用比較多［7-10］。其原理為設(shè)計(jì)外、內(nèi)兩對(duì)特異性PCR引物，進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。使用外側(cè)引物進(jìn)行首輪PCR。以得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行第二輪PCR來(lái)擴(kuò)增所需目的片段［11］。另外需要指出的是，使用RACE技術(shù)獲得新基因的末端片段時(shí)，需要盡可能多地選擇陽(yáng)性重組體進(jìn)行測(cè)序，獲得新基因全長(zhǎng)序列的幾率會(huì)更高。

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（編輯陳明偉）

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-4441（2015）02-0067-05

收稿日期:2015-03-27

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào):81160366）；廣西自然科學(xué)基金（編號(hào):2011jjA40535）通信作者:曾麒燕，E-mail:2257994291@qq.com